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    益胃湯對初老雌性大鼠下丘腦作用的差異蛋白分析*

    2018-10-22 03:03:40張英杰張美英隋凱悅
    天津中醫(yī)藥 2018年10期
    關(guān)鍵詞:雌鼠去勢通路

    張英杰,王 鵬,張美英,隋凱悅,路 芳

    (1.淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,淄博 255000;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250014;3.天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬武清中醫(yī)院,天津 301700)

    20世紀(jì)末中國進(jìn)入老齡化社會(huì),人口老齡化問題成為新的挑戰(zhàn)。隨著經(jīng)濟(jì)的日益發(fā)展,人們開始關(guān)注衰老方面的研究。衰老過程是復(fù)雜的,原因多樣,關(guān)于衰老的學(xué)說更是各不相同,有自由基學(xué)說、線粒體學(xué)說、遺傳學(xué)說等,其中比較公認(rèn)的是自由基學(xué)說。通過國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥大多從健脾補(bǔ)腎方向開展抗衰老研究。

    近年來,譚萬信教授等[1]根據(jù)《素問·上古天真論》中“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長……五七,陽明脈衰,面始焦,發(fā)始墮”的論述,提出補(bǔ)益陽明津氣可以延緩女性衰老,并取得一定的進(jìn)展。研究提示,益胃養(yǎng)陰生津的代表方益胃湯能夠通過改善中樞神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂的狀態(tài),調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能,進(jìn)而延緩初老雌鼠生殖軸衰老[2]。益胃湯組成藥物有北沙參、麥門冬、冰糖、細(xì)生地、玉竹。本實(shí)驗(yàn)旨在從蛋白質(zhì)水平探索益胃湯對下丘腦的調(diào)節(jié)作用,篩選并分析大鼠下丘腦具有顯著差異表達(dá)的蛋白,進(jìn)一步探尋益胃湯延緩衰老的分子機(jī)制。

    1 材料與儀器

    1.1 動(dòng)物 SD雌性大鼠30只,月齡10~12個(gè)月和4~6個(gè)月:由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。許可證號:scxk(京)2014-0004。

    1.2 藥物及試劑 北沙參、麥門冬、細(xì)生地、玉竹、生理鹽水(淄博市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院);冰糖(百貨商店);尿素(Urea)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、IPG buffer、甲酸(FA)(美國 GE 公司);十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸(TCA)、過硫酸銨(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)(美國Amresco公司);三乙二胺碳酸鹽(TEAB)、考馬斯亮藍(lán)G-250(美國Sigma公司);胰蛋白酶(美國Promega公司);乙腈(ACN)、水等(美國 Thermo公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 儀器 SciexTripleTOF5600質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司),配有納升噴霧Ⅲ離子源(美國SCIEX公司),Eksigent nanoLC-1D plus液相系統(tǒng)(美國SCIEX公司)以及Analyst TF 1.6數(shù)據(jù)處理軟件;Eppendorf冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);ImageScanner掃描儀(美國GE Healthcare公司);真空冷凍干燥機(jī)(美國Thermo公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)VCX130(美國Sonics公司);電泳儀Mini PROTEAN tetra Cell(美國Bio-Rad公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物分組及建模 30只健康雌性大鼠,普通飼料常規(guī)喂養(yǎng)。去勢組(4~6月齡)采用10%苯巴比妥,60 mg/kg ip,將大鼠麻醉成功后,切除雙側(cè)卵巢。切除卵巢24 h后進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)涂片,每日1次,連續(xù)5 d,若陰道角化細(xì)胞指數(shù)低于50%,則造模成功。同時(shí)初老組(10~12月齡)亦作陰道細(xì)胞學(xué)涂片,方法時(shí)間同去勢組相同,若陰道角化細(xì)胞指數(shù)高于50%,則為初老模型。正常組(10~12月齡)每天作陰道細(xì)胞學(xué)涂片,每日1次,連續(xù)5 d,以陰道角化細(xì)胞指數(shù)高于50%者為正常模型。

    2.2 給藥方法兩組均以益胃湯27 g/(kg·d)進(jìn)行灌胃,正常組以生理鹽水13.5 mL/(kg·d)進(jìn)行灌胃,連續(xù)灌胃4周。末次灌藥結(jié)束24 h后斷頭處死,取大鼠下丘腦組織。

    2.3 下丘腦組織處理 采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)分離、分析、鑒定大鼠下丘腦差異蛋白:1)蛋白提取和定量,本樣品濃度測定采用BCA蛋白濃度測定方法[3];2)胰蛋白酶酶解及標(biāo)記;3)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

    3 結(jié)果

    3.1 蛋白濃度測定結(jié)果 測定方法為聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定方法,結(jié)果見表1。

    表1 下丘腦蛋白樣品吸光度及濃度Tab.1 Absorbance and concentration of hypothalamus protein sample

    3.2 SDS-PAGE結(jié)果 用ImageScanner掃描儀掃描染色后的凝膠,SDS-PAGE測定結(jié)果見圖1。

    3.3 可信蛋白及差異蛋白篩選結(jié)果 酶解標(biāo)記后的下丘腦蛋白樣品利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析,分析后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。對得到的檢索結(jié)果按照Unused>1.3且peptide≥1,并去除空白值和反庫數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白,篩選結(jié)果為:可信蛋白3 706個(gè)。計(jì)算得到每一比較組的差異倍數(shù)Fold Change(FC)值和差異顯著性 P 值,以 FC>1.5或FC<2/3且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著蛋白,篩選結(jié)果初老組差異蛋白96個(gè),去勢組差異蛋白95個(gè)。圖2和圖3分別為初老組和去勢組下丘腦差異蛋白火山圖。對初老組和去勢組的差異蛋白取并集得到動(dòng)態(tài)變化蛋白173個(gè)。通過檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫,篩選出與衰老相關(guān)的蛋白共7個(gè)。其中,顯著上調(diào)者:纖溶酶原(plasminogen)、α-晶體蛋白 B 鏈(αcrystallin B Chain)、 血 清 轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白(serum transferrin)、非常規(guī)肌球蛋白-Id(wnconventional myosin Id)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、蛋白質(zhì)Fbxo4(4 Grotein Fbxo44);顯著下調(diào)者:Hsp70 結(jié)合蛋白 1(Hsp Toblinding protein 1)。

    圖1 下丘蛋白樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of hypothalamus protein sample

    圖2 初老組火山圖Fig.2 Volcano plot of precocious group

    圖3 去勢組火山圖Fig.3 Volcano plot of castrated group

    3.4 KEGG通路檢索結(jié)果 通過檢索KEGG Pathway Maps數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活性配體-受體相互作用、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、長壽調(diào)節(jié)途徑(多種)、HIF-1信號通路、磷酸酶活性的負(fù)調(diào)控通路、細(xì)胞黏附、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、抗原處理、泛素化和蛋白酶體降解、I類MHC介導(dǎo)的抗原加工和呈遞、免疫系統(tǒng)等通路與衰老有直接或間接的聯(lián)系。

    4 討論

    通過對正常組、初老組和去勢組下丘腦蛋白質(zhì)平均含量的綜合比較,最終確定在對初老雌鼠生殖機(jī)能衰老的影響上,共有7種具有顯著差異的蛋白質(zhì),它們分別為plasminogen、α-crystallin B chain、Hsp70 binding protein 1、serum transferrin、unconventional myosin-Id、myelin oligodendrocyte glycoprotein、protein Fbxo44。通過FC值比較發(fā)現(xiàn),其中除了Hsp70 binding protein 1之外的其他蛋白,在初老組中表達(dá)較去勢組更顯著,表明益胃湯對初老組干預(yù)作用較去勢組明顯。這些差異蛋白主要涉及免疫系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和催化、蛋白的代謝等過程,這些過程與衰老存在直接或間接的聯(lián)系。

    4.1 上調(diào)的差異蛋白基因(GO)分析和KEGG通路的討論分析

    4.1.1 纖溶酶原 纖溶酶原參與腫瘤侵襲和炎癥反應(yīng),纖溶酶原對應(yīng)基因?yàn)镻lg,參與的KEGG通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用,補(bǔ)體和凝血級聯(lián)。盧根林等[4]通過臨床研究發(fā)現(xiàn),急性胰腺炎(AP)患者血漿Plg活性減低明顯。Liu等[5]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森?。≒D)模型中,Plg可以通過恢復(fù)凋亡和自噬之間的平衡對PD起到治療作用。Per Svenningsen等[6]研究發(fā)現(xiàn),一些具有腎表達(dá)的纖溶酶原被表面受體激活后,可以通過在腎中表達(dá)的蛋白酶活化受體PAR發(fā)揮作用,并且對腎臟疾病的組織重塑和炎癥有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),益胃湯對Plg在蛋白酶激活過程中的作用是上調(diào)的。筆者認(rèn)為,Plg表達(dá)的提高,可能會(huì)增加細(xì)胞表面蛋白酶活化受體PAR的數(shù)量,誘發(fā)凝血反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子,對局部炎癥反應(yīng)或細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控,這可能是益胃湯延緩初老雌鼠生殖機(jī)能衰老的作用機(jī)制之一。

    4.1.2 α-晶體蛋白B鏈 α-晶體蛋白B鏈對應(yīng)基因?yàn)镃ryab,參與老化、凋亡過程涉及形態(tài)發(fā)生,活性氧代謝過程負(fù)調(diào)節(jié)。細(xì)胞衰老與纖維化、炎癥以及癌癥等多種疾病有著密切的關(guān)系[7]。α-晶體蛋白B鏈[8]廣泛存在于多種細(xì)胞中,屬于小分子熱休克蛋白家族,因此其亦具有熱休克蛋白家族的基本功能。α-晶體蛋白B鏈參與抗細(xì)胞凋亡過程,研究者發(fā)現(xiàn),其能抑制由細(xì)胞抵抗高溫、射線,缺氧,藥物等多種因素引起的細(xì)胞凋亡[9]。慢性炎癥是衰老進(jìn)程中主要的病理表現(xiàn),唐蜜[10]研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體D2可通過調(diào)節(jié)Cryab發(fā)揮抑制神經(jīng)炎癥的作用。通過本實(shí)驗(yàn)和KEGG通路查閱發(fā)現(xiàn),在益胃湯的作用下,Cryab的表達(dá)是上調(diào)的,筆者認(rèn)為益胃湯可能具有抗細(xì)胞凋亡的作用,同時(shí)亦具有多巴胺受體D2類似的作用,可以通過調(diào)節(jié)Cryab表達(dá)干預(yù)炎癥反應(yīng),延緩衰老。

    4.1.3 血清轉(zhuǎn)鐵蛋白 血清轉(zhuǎn)鐵蛋白對應(yīng)基因?yàn)門f,參與急性期反應(yīng)、鐵凋亡、細(xì)胞凋亡、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞增殖的正調(diào)控,參與ephrin-ephrin受體雙向信號軸,參與的KEGG通路為HIF-1信號通路。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子,其作為氧穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑起作用。王銀芳[11]在研究中指出,低氧可以誘導(dǎo)自噬,而且主要是通過HIF-1α/BNIP3信號通路實(shí)現(xiàn)的,同時(shí)低氧自噬與細(xì)胞的凋亡、侵襲性以及腫瘤的發(fā)生等具有重要關(guān)系。袁玉梅[12]研究發(fā)現(xiàn)修復(fù)衰老大鼠海馬神經(jīng)元完整自噬流可以抵抗應(yīng)激損傷,延緩衰老的進(jìn)程。同時(shí),Tf可以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)鐵凋亡,減少鐵蓄積,增加抗氧化應(yīng)激酶活性,緩解氧化應(yīng)激[13]。而從本實(shí)驗(yàn)益胃湯對基因表達(dá)的結(jié)果來看,Tf在HIF-1信號通路中是上調(diào)表達(dá),進(jìn)而筆者認(rèn)為益胃湯延緩初老雌性大鼠衰老的機(jī)制之一,可能是通過增加機(jī)體內(nèi)氧的運(yùn)輸量,從而降低低氧自噬的發(fā)生,減少了細(xì)胞凋亡。

    4.1.4 非常規(guī)肌球蛋白-Id 非常規(guī)肌球蛋白-Id對應(yīng)基因?yàn)镸yo1d,涉及前腦發(fā)育,細(xì)胞定位,參與磷酸酶活性的負(fù)調(diào)控通路。鎬振選[14]在研究中指出,多個(gè)和衰老相關(guān)的基因已經(jīng)被證實(shí)和血管功能障礙有關(guān),其中存在于樹突及神經(jīng)元胞體中的基因KNDC1,具有蛋白磷酸酶活性,而既往研究證明KNDC1mRNA轉(zhuǎn)錄及KNDC1蛋白表達(dá)在衰老的HUVECs中有所增加,同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲低KNDC1的表達(dá)后,內(nèi)皮細(xì)胞的衰老亦得到延緩。筆者認(rèn)為益胃湯可能作用于磷酸酶活性的負(fù)調(diào)控通路,通過干預(yù)非常規(guī)肌球蛋白-Id表達(dá)對具有磷酸酶活性的KNDC1進(jìn)行抑制,從而延緩大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老。邢方凱[15]在研究中指出,非常規(guī)肌球蛋白在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性中起重要作用,而突觸是防治與腦老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的靶點(diǎn)[16],因此筆者認(rèn)為非常規(guī)肌球蛋白-Id的顯著表達(dá)有利于延緩神經(jīng)系統(tǒng)衰老,亦可能是延緩初老雌鼠衰老的機(jī)制之一。

    4.1.5 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白對應(yīng)基因?yàn)镸og,參與老化與細(xì)胞黏附。近年來,研究發(fā)現(xiàn)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病相關(guān),神經(jīng)炎癥是一種免疫應(yīng)答反應(yīng),可以活化神經(jīng)細(xì)胞促使其釋放炎癥介質(zhì),并形成毒性循環(huán),致使神經(jīng)退行性改變,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞萎縮,細(xì)胞間突觸聯(lián)系和蘊(yùn)藏的生化物質(zhì)減少,機(jī)體接受和傳遞信息的能力降低,出現(xiàn)感覺遲鈍,反應(yīng)緩慢,記憶力下降,思維阻滯,腦功能降低的現(xiàn)象,這就是所謂的“腦老化”[17]。孫夢雅等[18]也表示,抑制Mog基因及蛋白表達(dá)可能是宮內(nèi)炎癥致新生大鼠腦組織損害的機(jī)制之一。因此筆者認(rèn)為,該基因的下調(diào)可能是導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和“腦老化”的因素之一,而益胃湯很可能是通過上調(diào)該基因表達(dá),阻止或延緩神經(jīng)炎癥和“腦老化”的發(fā)生,從而延緩初老雌鼠生殖軸的衰老。

    4.1.6 蛋白質(zhì)Fbxo44 蛋白質(zhì)Fbxo44對應(yīng)基因?yàn)镕bxo44,與泛素-蛋白轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的編碼有關(guān),參與蛋白酶體蛋白分解代謝過程,參與的KEGG通路有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、抗原處理、泛素化和蛋白酶體降解、I類MHC介導(dǎo)的抗原加工和呈遞、免疫系統(tǒng)。高歌[19]通過研究發(fā)現(xiàn)Fbxo44在乳腺癌中具有高表達(dá)傾向,并推測可能有助于乳腺癌的發(fā)展。Benita Sj?gren[20]通過免疫沉淀發(fā)現(xiàn)Fbxo44可以通過Cullin 4B/DDB1復(fù)合體CUL4B/DDB1/FBXO44 E3連接酶介導(dǎo)RGS2的降解,而RGS2與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),癌基因的活化可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,稱為癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[21]。因此筆者認(rèn)為益胃湯可能通過干預(yù)Fbxo44的表達(dá),在一定程度上抑制了癌基因的活化和惡性腫瘤的發(fā)生,影響了細(xì)胞衰老進(jìn)程,從而間接地延緩了初老雌鼠的衰老。

    4.2 下調(diào)的差異蛋白基因(GO)分析和KEGG通路的討論分析 Hsp70結(jié)合蛋白1對應(yīng)基因?yàn)镠spbp1,參與的KEGG通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工。宋硯坤等[22]通過研究發(fā)現(xiàn)Hsp70可以與抗凋亡基因Bcl-2結(jié)合調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖和信號傳導(dǎo)。褚曉蕾等[23]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)并推測,HSP70與Apaf-1結(jié)合量的增強(qiáng)可能是抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。在生物的應(yīng)激細(xì)胞中Hsp70結(jié)合蛋白常處于高度誘導(dǎo)狀態(tài),以保護(hù)機(jī)體和細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)Hspbp1在參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解過程中是下調(diào)表達(dá),益胃湯可能是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解過程中Hspbp1的表達(dá),避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂的發(fā)生,若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能持續(xù)紊亂,細(xì)胞將啟動(dòng)caspase12依賴的細(xì)胞凋亡程序,這些反應(yīng)被統(tǒng)稱為未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(UPR)[24]。Hspbp1的表達(dá)下調(diào)很可能可以抑制細(xì)胞啟動(dòng)凋亡程序,避免細(xì)胞死亡,這可能是益胃湯延緩初老雌鼠衰老的機(jī)制之一。

    5 小結(jié)

    縱觀整個(gè)課題,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和動(dòng)物模型的建立是關(guān)鍵部分。在初老模型動(dòng)物選擇方面,根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn),考慮到益胃湯干預(yù)衰老的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該在“五七”之前,即“未老先防”,因此本課題選擇生殖生理內(nèi)環(huán)境接近女性“五七”之年的10~12月齡SD雌鼠進(jìn)行研究。結(jié)果表明,益胃湯延緩初老雌鼠生殖機(jī)能衰老的可能機(jī)制有:抗炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、減少腫瘤的發(fā)生,該結(jié)論亦為本課題后續(xù)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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