活血膏對膝骨性關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨Wnt/βcatenin信號通路的影響

周偉 吳進 林曉光 林凱 鄭紅波

摘要 目的：觀察活血膏對骨性關節(jié)炎模型大鼠運動能力的干預效應，同時評估其對關節(jié)軟骨超微結構以及Wnt/β-catenin信號通路標志性蛋白表達的影響。方法：將30只SD大鼠隨機分為空白組、模型組以及活血膏組，每組10只。其中模型組及活血膏組大鼠接受4%木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射以復制骨性關節(jié)炎模型，隨后活血膏組大鼠接受活血膏外用涂抹，連續(xù)干預14d，比較3組大鼠關節(jié)腔軟骨下骨組織形態(tài)學、軟骨形態(tài)以及軟骨組織Wnt-2、β-catenin含量的變化。結果：1）接受造模的大鼠膝關節(jié)活動度明顯低于空白組，其中活血膏組大鼠膝關節(jié)活動度大于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。2）模型組大鼠骨小梁出現(xiàn)明顯硬化現(xiàn)象，局部存在斷裂，骨小梁排列順序紊亂，可見骨贅形成，活血膏組大鼠骨小梁排列明顯較模型組整齊，斷裂現(xiàn)象明顯減少。接受造模大鼠BS/BV較空白組升高，Tb.Th及Tb.N均較空白組下降，其中活血膏組較模型組改善，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；3）HE染色顯示空白組大鼠軟骨面形態(tài)正常，基質著色均勻正常，潮線清晰可見；模型組大鼠軟骨出現(xiàn)不同程度的纖維化，軟骨細胞數(shù)量減少，潮線模糊不清；活血膏組軟骨細胞較模型組增多，可見部分潮線。4）WesternBlot檢測法提示模型組軟骨組織Wnt-2、β-catenin含量較空白組明顯升高，活血膏組雖較空白組上調但較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：活血膏對骨性關節(jié)炎大鼠的軟骨及軟骨下骨有保護效應，其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路表達有關。

關鍵詞 膝骨性關節(jié)炎；大鼠；軟骨；軟骨下骨；活血膏；Wnt-2；β-catenin

AbstractObjective：ToobservetheinterventioneffectofHuoxueointmentonthemotorfunctionofosteoarthritisrats，andtoevaluateitseffectontheultrastructureofarticularcartilageandtheexpressionofWnt/β-cateninsignalingpathway.Methods：Atotalof30SDratswererandomlydividedintoblankgroup，modelgroupandHuoxueointmentgroup，with10ratsineachgroup.ThemodelgroupandHuoxueplastergroupweretreatedwithintra-articularinjectionof4%papaintoreplicatetheosteoarthritismodel，thenHuoxueointmentgroupweretreatedwithexternalapplicationofHuoxueointment，interventionfor14consecutivedays.Ratarticularsubchondralbonetissuemorphology，cartilagemorphologyandcartilagetissueWnt-2，beta-cateninofthreegroupswerecompared.Results：1）Theactivityofthekneejointinthemodelratswassignificantlylowerthanthatintheblankgroup，andthemotionrangeofthekneejointsinHuoxueointmentgroupwasgreaterthanthatinthemodelgroup.Thedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.2）Thetrabecularboneshowedobvioushardeningphenomenoninthemodelgroup.Therewerelocalfractures.Thetrabeculararrangementwasdisorder.Theformationofosteophytewasobserved.ThebonetrabeculararrangementinHuoxueointmentgroupwassignificantlymorethanthatinthemodelgroup，andthefracturephenomenonwassignificantlyreduced.BS/BVofratswithmodelestablishmentelevatedsignificantlycomparedwithcontrolgroup，andTb.ThandTb.Nwerelowerthanthatinblankgroup.Thehuoxueointmentgroupimprovedcomparedwiththemodelgroup，andthedifferenceswerestatisticallysignificant（P<0.05）.3）HEstainingshowedthattheratsincartilagematrixoftheblankgrouphadnormalmorphology，anduniformcoloringwasnormalwithvisibleandcleartideline.Thecartilageinmodelgroupshoweddifferentdegreesoffibrosis，andthenumberofcartilagecellswasdecreased.Thetidallinewasblurred；ChondrocytesofHuoxueointmentgroupincreasedincomparisonwiththemodelgroup，andpartofthetidallinewasvisible.4）WesternBlottestshowedthattheWnt-2andβ-cateninlevelsofcartilagetissueinmodelgroupweresignificantlyhigherthanthoseinblankgroup，whileHuoxueointmentgroupwashigherthanthatinblankgroup.Itwassignificantlylowerthanthatinmodelgroup，andthedifferencewasstatisticallysignificant（P<0.05）.Conclusion：Huoxueointmentcanprotectcartilageandsubchondralboneinosteoarthritisrats，anditsmechanismmayberelatedtoinhibitingtheexpressionofWnt/β-cateninsignalingpathway.

KeyWordsKneeosteoarthritis；Rats；Cartilage；Subchondralbone；Huoxueointment；Wnt/β-catenin

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.046

當關節(jié)軟骨產生退行性改變或繼發(fā)性骨質增生后導致骨性關節(jié)炎的形成（KneeOsteoarthritis，KOA），明顯降低了生命質量，因膝關節(jié)是KOA最易受累的關節(jié)，故又稱膝骨性關節(jié)炎[1-2]。盡管KOA具有極高的發(fā)病率，但治療方法確明顯滯后于其他類型的關節(jié)炎，目前以非甾體消炎藥為主，雖在一定程度可減輕患者的臨床癥狀，但其對消化道破壞的不良反應嚴重影響了治療依從性。中醫(yī)藥以其療效顯著、不良反應少的優(yōu)勢逐漸受到臨床工作者的青睞，其在KOA領域的療效臨床亦不乏報道[3-5]。KOA屬于中醫(yī)學“骨痹”“痛痹”范疇，肝腎不足，氣滯血瘀是膝骨關節(jié)炎的主要病機，因此補益肝腎，益氣活血化瘀是其治療的原則。本團隊經過臨床不斷實踐總結出活血膏，其以外用的形式對KOA進行治療，獲得明顯的臨床療效，但其作用機制目前尚未明了，基于此我們以4%木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射以復制骨性關節(jié)炎模型大鼠，以微觀CT、HE染色及WesternBlot檢測法為手段，對活血膏的作用機制進行探析，具體報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物購買30只雄性SpragueDawley（SD）大鼠，進行為期7d適應性喂養(yǎng)，體重278～308g，平均體重（281±19.28）g。所有大鼠均購自上海SLAC實驗動物有限責任公司提供（合格證號：SCXK（瀘）2007—0005）。飼養(yǎng)溫度20～23℃，實驗濕度50%～55%，所有大鼠均只有飲水飲食。晝夜12h/12h交替。

1.1.2藥物活血膏（當歸15g、赤芍15g、川芎15g、紅花20g、土鱉蟲20g、龍血竭2g、白芍15g、威靈仙15g、桑寄生20g、寬筋藤15g、乳香15g、白及15g、烏藥15g、冰片2g），所有中藥飲片由醫(yī)院中藥房提供，將上述藥物按比例配伍混勻，60℃干燥，粉碎研磨成微細顆粒，與加熱的凡士林攪拌調勻成糊狀。

1.1.3試劑與儀器4%木瓜蛋白酶（購自上海生工生物公司），Mnt-2、β-catenin一抗抗體（購自美國CST公司），堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體（購自CellSignaling公司），10%水合氯醛（購自凱福達化工有限公司），SDS-PAGE電泳膠及電泳槽（購自碧云天公司），BCA蛋白試劑盒（購自西安晶彩生物有限公司），顯微CT掃描儀（德國YxLON公司生產）。

1.2方法

1.2.1分組與造模方法將30只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為空白組、模型組及活血膏組，每組10只。3組大鼠均將膝關節(jié)及其周圍毛發(fā)剔除，模型組及活血膏組大鼠在造模第1天、第4天及第7在接受右側膝關節(jié)關節(jié)腔注射4%木瓜酶溶液50μL，空白組大鼠在相同時間內注射等劑量的生理鹽水。

1.2.2干預方法在模型制備的同時給藥，空白組及模型組大鼠在膝關節(jié)及其周圍涂抹凡士林，活血膏組涂抹事先制備的活血膏，1次/d，持續(xù)6～8h，連續(xù)干預14d。

1.3觀察指標與方法

1.3.1膝關節(jié)活動度由同一個實驗員于室溫下測試各組大鼠膝關節(jié)活動度，將各組大鼠膝關節(jié)等距離處垂直施予等力度的牽拉回縮大鼠右側膝關節(jié)，用測量器測量伸展之回縮的角度，連續(xù)測量3次計算平均值。

1.3.2顯微CT掃描觀察關節(jié)軟骨下骨形態(tài)學隨機抓取各組3只大鼠，脫頸處死后將右側髖關節(jié)至踝關節(jié)處充分分離，將肌肉等組織剔除后固定于4%多聚甲醛液體內3d，隨后用顯微CT儀對右膝關節(jié)進行掃描。參數(shù)設定：電流44μA，能量80kVp，積分時間600ms，體素14μm。對脛骨平臺及股骨內外側髁的股形態(tài)參數(shù)進行觀察。記錄骨表面積與體積比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）及骨小梁數(shù)量（Tb.N）。

1.3.3HE染色觀察關節(jié)軟骨形態(tài)隨機抓取各組3只大鼠，脫頸處死后取脛骨平臺軟骨，修剪成大小約0.5cm×0.5cm×0.5cm，固定于4%多聚甲醛液體內，隨后進行常規(guī)脫水、脫鈣、石蠟包埋、修切、脫蠟，隨后將切片固定10～30s，再用蘇木精-伊紅染色，用高倍顯微鏡觀察不同組別膝關節(jié)軟骨的形態(tài)。

1.3.4Westernblot檢測Mnt-2、β-catenin蛋白表達隨機抓取各組3只大鼠，以0.3mL/Kg比例腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，脫頸處死后取脛骨平臺軟骨，修剪成重量約50mg，加入1mL蛋白裂解液充分裂解組織，隨后進行高速離心，吸取上清液，用DAB試劑盒進行蛋白定量，將樣本進行蛋白變性，隨后將樣本加入電泳凝膠中進行蛋白分離，截取目的蛋白膠體后進行轉膜，封閉后加入Mnt-2、β-catenin及β-actin抗體，孵育過夜后用TBS沖洗，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體后室溫下孵育2h，用TBS（Tris-HCl緩沖鹽溶液）清洗條帶后進行顯色測定，計算出最終OD值。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對本研究所得數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢測，符合正態(tài)分布用T檢驗，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1各組大鼠膝關節(jié)活動度比較接受造模的大鼠膝關節(jié)活動度明顯低于空白組，其中活血膏組大鼠膝關節(jié)活動度大于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2各組關節(jié)軟骨下骨的形態(tài)學變化通過CT掃描可知模型組大鼠骨小梁出現(xiàn)明顯硬化現(xiàn)象，局部存在斷裂，骨小梁排列順序紊亂，可見骨贅形成，活血膏組大鼠骨小梁排列明顯較模型組整齊，斷裂現(xiàn)象明顯減少。接受造模大鼠BS/BV較空白組升高，Tb.Th及Tb.N均較空白組下降，其中活血膏組較模型組改善，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表2。

2.3各組膝關節(jié)軟骨形態(tài)學變化HE染色顯示空白組大鼠軟骨面形態(tài)正常，基質著色均勻正常，潮線清晰可見；模型組大鼠軟骨出現(xiàn)不同程度的纖維化，軟骨細胞數(shù)量減少，潮線模糊不清；活血膏組軟骨細胞較模型組增多，可見部分潮線。見圖2。

2.4各組關節(jié)軟骨Wnt-2、β-catenin含量變化WesternBlot檢測法提示模型組軟骨組織Wnt-2、β-catenin含量較空白組明顯升高，活血膏組雖較空白組上調但較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3、圖3。

3討論

骨性關節(jié)炎屬于中醫(yī)學“骨痹”“筋痹”等范疇，與肝腎關系極為密切，腎主骨生髓，在體合骨[6-7]?！端貑枴け哉摗分醒裕骸澳I者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故是不任厚，發(fā)為骨痛”，《素問·六節(jié)藏象論》中寫到“腎，其充在骨”，腎精充足，骨髓生化有源，骨骼得到髓的滋養(yǎng)，堅固有力，故腎氣旺盛，腎精充足則骨骼強健，生發(fā)有力。肝主藏血，在體合筋，肝精肝血充足，筋得其養(yǎng)，機體運動靈活有力，《素問·陰陽應象大論》稱為“肝主筋”，乃“罷極之本”。如若肝精虧虛，筋不得濡養(yǎng)，則可出現(xiàn)筋力虛弱，運動不利[8-9]。肝腎虧虛加之寒濕之邪侵襲，筋骨骨節(jié)氣血凝滯，不通則痛，或勞倦內傷，氣血津液耗傷，進一步加劇氣血瘀滯之勢，經絡痹阻而發(fā)本病，正如清代醫(yī)家張璐在《張氏醫(yī)通·諸痛門》中描述：“膝者，筋之府，無有不因肝腎虛者，虛者風寒濕襲之”，故補益肝腎，活血化瘀是治療本病的關鍵。

活血膏是我院前輩專家留下的驗方，經改良研發(fā)而成。采取中藥藥膏外敷治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎操作簡單、療效明顯，不良反應小，安全性高，其與西醫(yī)方法進行有機結合，對于緩解膝關節(jié)疼痛，促進肢體功能恢復，提高患者生命質量，不僅具有重要的臨床價值，而且有良好的應用前景。方中當歸性溫，是活血補血之良品；赤芍可涼血活血，二藥合用共奏緩急止痛之功[10-12]。川芎是血中之氣藥，可溫經行氣活血，又有祛風止痛的作用；紅花有理想的溫經活血、祛瘀止痛的作用，正如《本草正義》寫到：“性本溫和氣兼辛散，凡瘀滯內積及經絡不利諸證，皆其專之”。土鱉蟲及血竭可破血散瘀，使筋骨間瘀血散而止痛。白芍可養(yǎng)血柔肝，肝血旺則可緩筋骨拘攣止痛。威靈仙具祛風除濕、通絡止痛之功效。桑寄生有補益肝腎之功，與寬筋藤合用，即可補益肝腎又可祛風舒筋。乳香是“定諸經之痛”之良品，與白及合用，共奏消腫生肌之功。烏藥行氣止痛，溫腎散寒。冰片芳香走竄，消腫止痛，同時增強外用藥滲透作用。整方共奏補益肝腎、活血化瘀之功[13-14]。本研究數(shù)據(jù)顯示活血膏組大鼠不論在改善膝關節(jié)活動度方面還是改善關節(jié)相關組織的形態(tài)學方面均明顯優(yōu)于模型組，這說明活血膏確對膝骨性關節(jié)炎有理想療效，對膝關節(jié)軟骨及軟骨下骨均有明顯的修復效應。

在對活血膏作用機制的探討中我們對各組大鼠膝關節(jié)軟骨的Wnt/β-catenin通路標志性蛋白表達水平進行檢測。膝骨性關節(jié)炎Wnt/β-catenin通路可維持軟骨細胞外基質降解及骨贅形成的動態(tài)平衡，Wnt/β-catenin通路激活后軟骨細胞病理性成熟增強，生理性凋亡被制止，則關節(jié)的穩(wěn)態(tài)受破壞，軟骨細胞外基質被過度降解，從而導致軟骨細胞肥厚以及軟骨退化，最終形成骨贅[15-18]。因此抑制Wnt/β-catenin通路過表達是治療膝骨性關節(jié)炎的關鍵。研究中我們對各組大鼠膝關節(jié)軟骨組織的Wnt-2、β-catenin含量進行測定，結果顯示模型組軟骨組織Wnt-2、β-catenin含量較空白組明顯升高，活血膏組雖較空白組上調但較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這說明膝骨性關節(jié)炎發(fā)病后的確存在Wnt/β-catenin通路被激活現(xiàn)象，而活血膏可明顯抑制這一過程。

綜上所述，Wnt/β-catenin通路被激活可能是膝骨性關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的機制之一，而活血膏可能正是通過這一途徑發(fā)揮臨床治療效應。

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（2018-03-12收稿責任編輯：王明）