糖腎方對(duì)db/db小鼠腎臟纖維化的保護(hù)作用

劉鵬 陳姣伊 劉言振?┱棗面? 張浩軍 嚴(yán)美花 趙海玲 李平

摘要 目的：觀察糖腎方（TangShenFang，TSF）對(duì)于自發(fā)性2型糖尿病腎病db/db小鼠腎臟纖維化的保護(hù)作用。方法：8周齡雄性db/db小鼠隨機(jī)分為2組，分別為模型組（db/db）和觀察組（db/db+TSF），每組9只；8周齡雄性db/m小鼠為正常對(duì)照組（db/m），順應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，給予糖腎方干預(yù)12周，處死小鼠，分離小鼠腎臟用于后續(xù)檢測(cè)。利用PAS和Masson染色觀察腎臟病理；利用WesternBlotting、Real-timePCR和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)腎臟組織纖維化TGF-β1/Smad3通路以及miRNA21和miRNA29b的表達(dá)。結(jié)果：糖腎方可以改善db/db小鼠尿微量白蛋白水平，減輕小鼠腎臟損傷；WesternBlotting、Real-timePCR和免疫組化結(jié)果顯示，糖腎方可下調(diào)db/db小鼠腎臟中纖維化標(biāo)志分子TGF-β1、Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表達(dá)；下調(diào)db/db小鼠腎臟miRNA21的表達(dá)，上調(diào)miRNA29b的表達(dá)。結(jié)論：糖腎方可作用于TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制腎臟纖維化。

關(guān)鍵詞 糖腎方；糖尿病腎?。荒I臟纖維化；miRNA

AbstractObjective：ToobservetheeffectsofTangshenFormula（TSF）treatmentonrenalfibrosisandexploreitspotentialmechanismindb/dbmice.Methods：Eightweeksolddb/dbanddb/mmicewererandomlydividedintothreesubgroups，（db/m，db/db，db/db+TSF），andallmicewerefedwithanormaldiet.Aftertwoweeksadaptation，miceweremaintainedonTSFtreatmentfor12weeksandwerethensacrificedunderanesthesiaafterovernightfast.Animalurineandrenaltissuessampleswerecollectedforfurtheranalyses.ThekidneyswerewashedwithcoldPBSsolution；onepartoftherenaltissuewerestoredinliquidnitrogen，andanotherdeposited-80℃directlyforsubsequentfrozensections；therestofthekidneywerefixedintotheneutralformalinforpathologicalanalysis.TherenalfibrosiswasdetectedbyPASandMassonstaining.TherenalexpressionofTGF-β1/Smad3anditstargetgeneswereassessedbyWesternBlotting，real-timePCR，andIHC.Results：TSFdiminishedUACRofdb/dbmice.HistologicalanalysisusingPASandMassonstainingrevealedtheoccurrenceofmesangialmatrixexpansionandextracellularmatrixdepositioninthekidneysofdb/dbmice.ThetreatmentwithTSFsignificantlyamelioratedthesehistologicalrenalinjuriesindb/dbmice.WesternBlottingandreal-timePCRanalysisshowedthatexpressionlevelsofTGF-β1，Smad3，CollagenⅠandFibronectinweresignificantlydownregulatedinthedb/dbmicewithTSFtreatment.WithTSFtreatment，theexpressionlevelsofmiRNA21wasdownregulated，buttheexpressionlevelsofmiRNA29bwasupregulated.Conclusion：TSFattenuatedrenalfibrosisindb/dbmice，throughsuppressionofTGF-β1/Smad3pathway.

KeyWordsTangshenformula；Diabeticnephropathy；Renalfibrosis；miRNA

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.010

糖尿病腎?。―iabeticNephropathy，DN）是糖尿?。―iabetesMellitus，DM）主要的微血管并發(fā)癥之一，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)終末期腎?。‥ndStageRvenalDisease，ESRD）的主要原因[1-2]。DN主要病理改變是由于細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，腎小球基底膜的厚度增加，進(jìn)而導(dǎo)致系膜增殖和擴(kuò)張，最終發(fā)展成為腎小球硬化和腎臟纖維化，喪失正常的功能。在DN的早期階段（微量白蛋白尿階段），膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白在腎小球基底膜和系膜細(xì)胞外基質(zhì)中的沉積明顯增加，導(dǎo)致糖尿病彌漫性腎小球硬化癥；在晚期階段，腎臟中Ⅰ型和Ⅲ型膠原明顯沉積[3]。由此可見，纖維化是DN腎臟病理的最主要特征。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是一種廣譜細(xì)胞因子，可被高血糖、晚期糖基化終產(chǎn)物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）、促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedProteinKinase，MAPK）和蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）等多種途徑誘導(dǎo)，在導(dǎo)致DN纖維化過程中發(fā)揮著決定性的作用[4]。多項(xiàng)研究表明TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是引起糖尿病腎病腎臟纖維化的重要通路，此外TGF-β1還可通過調(diào)控一些微小RNA（MicroRNA，miRNA）進(jìn)一步引起腎臟損傷（如：miRNA21，miRNA29等）[5-6]。因此，TGF-β/Smad3信號(hào)通路已成為防治DN的重要靶點(diǎn)之一。

目前的治療方案尚不能產(chǎn)生顯著的療效，因此迫切需要新的治療方法來減緩DN的進(jìn)展[7]。中醫(yī)藥是祖國(guó)瑰寶，同時(shí)國(guó)內(nèi)的糖尿病腎臟疾?。―iabeticKidneyDiseases，DKD）患者廣泛接受中醫(yī)藥的治療[8]。中藥糖腎方（TangshenFormula，TSF）顆粒是由七味藥組成，分別為黃芪、生地黃、山茱萸、三七、衛(wèi)矛、熟大黃和枳殼，是李平教授團(tuán)隊(duì)在繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合自身臨床實(shí)踐和現(xiàn)代研究成果擬定的中藥復(fù)方。在國(guó)家“973計(jì)劃”和國(guó)際科技合作等項(xiàng)目資助下，課題組前期多中心臨床試驗(yàn)證實(shí)糖腎方可以減少DKD患者尿蛋白排泄率，改善腎小球?yàn)V過率[9]。本研究主要探討糖腎方對(duì)于腎臟纖維化的影響。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物雄性自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠，8周齡，體重（35±5）g；同遺傳背景db/m小鼠，體重（20±2）g，購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0001。小鼠均飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室屏障環(huán)境，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2010-0011。溫度：（23±3）℃，相對(duì)濕度（55±15）%，保持12h光照/12h黑暗交替，自由飲水和常規(guī)飼料喂養(yǎng)。本次實(shí)驗(yàn)所有操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2藥物糖腎方配方顆粒，由江陰天江藥業(yè)有限公司制劑，規(guī)格：8g/袋，批號(hào)：1206346。糖腎方組成藥物為：黃芪、衛(wèi)矛、生地黃、枳殼、山茱萸、大黃、三七7味中藥，其重量比依次為10∶5∶4∶3.4∶3∶2∶1。

1.1.3試劑與儀器小鼠白蛋白Elisa試劑盒（美國(guó)BethylLaboratories公司）；iQTMSYBRGreensupermix（美國(guó)Bio-RAD公司）；蛋白預(yù)染Marker（中國(guó)天根生化科技有限公司）；PVDF膜（德國(guó)MerckMillipore公司）；CollagenⅠ抗體（美國(guó)SantaCruz公司）；Fibronectin抗體（美國(guó)SantaCruz公司）；Smad3抗體（美國(guó)CellSignalingTechnology公司）；P-Smad3抗體（美國(guó)CellSignalingTechnology公司）；β-actin抗體（美國(guó)SantaCruz公司）；辣根酶標(biāo)記兔抗小鼠IgG（美國(guó)DAKO公司）；Trizol試劑（美國(guó)SantaCruz公司）；QuickstartBradfordDyeReagent（美國(guó)Bio-RAD公司）；TaqmanmiRNA試劑盒（美國(guó)ThermoFisher公司）；BSA（美國(guó)Amresco公司）。CD-1600全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雅培公司）；BX43型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；PH儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；垂直凝膠電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）；Nanodrop高精度核算分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher公司）；PCR儀（美國(guó)Bio-RAD公司）；real-timePCR儀（美國(guó)Bio-RAD公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購入后，順應(yīng)性喂養(yǎng)2周，稱重并進(jìn)行基礎(chǔ)狀態(tài)觀察，于10周齡時(shí)根據(jù)體重將db/db小鼠隨機(jī)分為2組。

1.2.2給藥方法動(dòng)物分組后從第1天開始灌胃給藥，1次/d，每周稱重，連續(xù)給藥12周。糖腎方劑量參考前期臨床研究并按照標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物劑量換算[10]，根據(jù)體重按照體表面積進(jìn)行換算，糖腎方的臨床給藥劑量是16g/d，按照人的標(biāo)準(zhǔn)體重為60kg計(jì)算，小鼠體重按照20g計(jì)算，小鼠給藥劑量應(yīng)為人給藥劑量的9倍，則小鼠給藥劑量為還是2.4g/（kg·d）[9]。糖腎方顆粒劑按照0.18g/mL的濃度進(jìn)行配制，4℃保存，灌胃前取出恢復(fù)至室溫，混勻后備用。各組小鼠灌胃給藥方案如下表所示見，表1.1。

1.2.3標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)期間從給藥0周開始，每4周將小鼠轉(zhuǎn)移入代謝籠一次，小鼠禁食但不禁水，收集24h尿液后測(cè)定尿量，混勻后留取1.5mL，10000rpm4℃離心5min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于檢測(cè)尿白蛋白及尿肌酐水平。在給藥12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12h后，眼內(nèi)眥取血，3000r/min4℃離心15min，留取上清液，保存于-80℃冰箱用于檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)。之后迅速打開小鼠腹腔，摘取雙側(cè)腎臟，分別稱重。一側(cè)腎臟去除髓質(zhì)后，一半置于10%中性福爾馬林溶液中固定，另一半置于4%多聚甲醛中固定；另一側(cè)分離出腎皮質(zhì)，迅速置于干燥凍存管中，于液氮保存。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo)與方法取尿液上清，檢測(cè)尿白蛋白濃度和尿肌酐；并計(jì)算尿白蛋白肌酐比值（UrineAlbumin-to-CreatinineRatio，UACR）。腎組織經(jīng)過10%中性福爾馬林固定24h后，依次進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋后，使用切片機(jī)分別切為3μm厚切片，進(jìn)行過碘酸-雪夫（PeriodicAcid-Schiff，PAS）染色和Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織病理變化，采用評(píng)分法對(duì)其進(jìn)行半定量分析。采用WesternBlotting以及免疫組化法檢測(cè)腎臟組織中Smad3、P-Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的表達(dá)情況，采用Real-timePCR檢測(cè)腎臟組織中TGF-β1Smad3、CollagenⅠ和Fibronectin的mRNA水平以及miRNA21和miRNA29b的表達(dá)情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，采用GraphPadPrism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-wayANOVA分析和Dunnett-t多組間比較等檢驗(yàn)方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1糖腎方對(duì)db/db小鼠UACR的影響尿微量白蛋白是評(píng)價(jià)DN病情進(jìn)展的重要指標(biāo)，本研究中以尿肌酐進(jìn)行校正，使用UACR作為評(píng)價(jià)病情進(jìn)展。如圖1.1B所示。在10周齡實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，模型組db/db小鼠UACR顯著高于正常組db/m小鼠，而模型組與糖腎方組db/db小鼠UACR無明顯差異；從18周齡開始，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠UACR顯著降低，抑制病情進(jìn)展。圖1.1中，db/m表示正常對(duì)照組，db/db表示模型組，db/db+TSF表示糖腎方觀察組。

2.2糖腎方顯著改善db/db小鼠腎臟病理損傷腎臟組織經(jīng)過PAS染色后，糖原在光鏡下呈紫紅色顆粒。如圖1.2A所示。正常組db/m小鼠腎小球的結(jié)構(gòu)正常，系膜區(qū)陽性物質(zhì)未見增多；模型組db/db小鼠腎小球官腔的結(jié)構(gòu)異常，系膜區(qū)陽性物質(zhì)明顯增多，同時(shí)伴有系膜基質(zhì)顯著增生以及基底膜增厚；在給予糖腎方干預(yù)后，可明顯改善db/db小鼠腎小球系膜基質(zhì)的増生及基底膜增厚，同時(shí)對(duì)腎小球系膜基質(zhì)百分比進(jìn)行半定量分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1.2B。

經(jīng)過Masson染色后，膠原在光鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色。如圖1.2C所示。正常組db/m小鼠腎小球和腎小管的結(jié)構(gòu)正常，膠原表達(dá)未見增多；模型組db/db小鼠腎小球系膜區(qū)及基底膜膠原出現(xiàn)明顯的增生，同時(shí)出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張；給予糖腎方干預(yù)后，可明顯減少db/db小鼠腎小球及小管間質(zhì)的膠原沉積，使用纖維化面積進(jìn)行半定量分析，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1.2D。

2.3糖腎方對(duì)db/db小鼠腎臟皮質(zhì)CollagenⅠ和Fibronectin蛋白及mRNA水平的影響如圖1.3所示，免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)CollagenⅠ和Fibronectin白水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平顯著下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見圖1.4所示。WesternBlotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)CollagenⅠ和Fibronectin蛋白水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平顯著下降。如圖1.5所示。Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白mRNA水平顯著下降。

2.4糖腎方對(duì)db/db小鼠腎臟皮質(zhì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響如圖1.6所示，WesternBlotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中Smad3蛋白磷酸化水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)Smad3蛋白磷酸化水平顯著下降。如圖1.7所示，real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中TGF-β1mRNA水平顯著高于正常組db/m小鼠，在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)TGF-β1mRNA水平顯著下降。

2.5糖腎方對(duì)db/db小鼠腎臟皮質(zhì)miRNA21和miRNA29b的影響miRNA是可以調(diào)節(jié)各項(xiàng)生命活動(dòng)的小內(nèi)源非編碼RNA，抑制目標(biāo)基因翻譯和/或誘導(dǎo)mRNA降解，Smad3介導(dǎo)的miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用。如圖1.8所示，real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中miRNA21水平顯著高于正常組db/m小鼠，miRNA29b水平顯著低于正常組db/m小鼠；在給予糖腎方干預(yù)后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中miRNA21水平顯著下降，miRNA29b水平顯著升高。

3討論

我國(guó)已經(jīng)成為了全球DM患者最多的國(guó)家，而且患病人數(shù)還在繼續(xù)增加，最新的研究顯示我國(guó)目前DM的患病率已經(jīng)達(dá)到了10.9%，同時(shí)糖尿病前期的人口預(yù)計(jì)在35.7%[11]。DN作為DM主要的微血管并發(fā)癥之一，已成為ESRD的主要病因，嚴(yán)重威脅著人類的健康，給國(guó)家和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)糖腎方可顯著抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)，下調(diào)Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)，減輕腎臟纖維化；此外研究還發(fā)現(xiàn)糖腎方還可通過下調(diào)腎臟中miRNA21的表達(dá)以及上調(diào)miRNA29b的表達(dá)，抑制腎臟纖維化的進(jìn)展，保護(hù)腎臟功能。

TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是引起糖尿病腎病腎臟纖維化的重要通路，可引起ECM的過度沉積，導(dǎo)致腎臟纖維化[6]。DN狀態(tài)下的許多物質(zhì)，例如高血糖水平、AGEs及血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）都可上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，并通過依賴及非依賴TGF-β1途徑激活Smad信號(hào)通路。Smad3可直接結(jié)合到膠原蛋白的啟動(dòng)子區(qū)域，來上調(diào)膠原蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腎臟的纖維化進(jìn)展[12-13]。同時(shí)降低成纖維細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶-1（Matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）活性，減少膠原蛋白的降解[14]。DN、UUO、高血壓腎損害及藥物導(dǎo)致的腎損害動(dòng)物模型中，敲除Smad3均可抑制腎臟的纖維化[15-18]。TGF-β1/Smad信號(hào)通路導(dǎo)致腎臟纖維化的主要機(jī)制有：1）可通過誘導(dǎo)膠原和纖維連接蛋白的表達(dá)，直接引起ECM的過度沉積[19]；2）可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Epithelial-mesenchymaltransition，EMT）轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞通過巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞（Macrophage-myofibroblasttransition，MMT），以及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Endothelial-mesenchymaltransition，EndMT）為肌成纖維細(xì)胞[20-21]；3）可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞分泌增強(qiáng)，導(dǎo)致系膜基質(zhì)增多；還可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞和足細(xì)胞的凋亡，影響腎臟正常的功能，加重腎臟的纖維化[22]；4）降低成纖維細(xì)胞中的MMP-1活性，減少膠原蛋白的降解[14]。所以，TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活可顯著促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)展，可作為治療DN的潛在靶點(diǎn)。

在一項(xiàng)納入1604例DN患者的meta分析中發(fā)現(xiàn)，DN患者的血清和尿液中的TGF-β1含量顯著升高[23]。一些TGF-β1的抑制劑已經(jīng)進(jìn)行了臨床前和臨床研究，但由于不良反應(yīng)以及療效不顯著等原因，還尚未得到廣泛的應(yīng)用[24]。在一項(xiàng)有77例DN患者參與的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，一種可以阻斷TGF-β1啟動(dòng)子的小分子藥物Pirfenidone，可延緩DN患者的腎小球?yàn)V過率（EstimatedGlomerularFiltrationRate，eGFR）的下降[25]。但在有36例激素抵抗型原發(fā)局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，給予人源的TGF-β1單克隆抗體fresolimumab（GC1008）后并未發(fā)現(xiàn)患者的eGFR有明顯改善[26]。

miRNA是可以調(diào)節(jié)各項(xiàng)生命活動(dòng)的小內(nèi)源非編碼RNA，長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸，可與靶基因的3′端非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制目標(biāo)基因翻譯和/或誘導(dǎo)mRNA降解，其中一些miRNA（例如：miRNA21，miRNA29等）在糖尿病腎臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[6]。miRNA21是被廣泛研究的miRNAs之一，早在2008年的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，心力衰竭模型中miRNA21可加重心臟的纖維化[27]。盡管在正常腎臟中miRNA21的含量比較低，但是在多種腎臟疾病模型中，例如糖尿病腎病和急性腎小球腎炎的動(dòng)物模型中，均可發(fā)現(xiàn)miRNA21表達(dá)升高，腎臟發(fā)生纖維化改變[28-29]。已有大量研究表明，TGF-β1可上調(diào)miRNA21的表達(dá)；在敲除TGF-β1的糖尿病模型中，miRNA21的表達(dá)減少，腎臟纖維化程度減輕[30]。因此，miRNA21可成為改善纖維化相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)；在敲除miRNA21的小鼠模型中也進(jìn)一步證實(shí)，敲除miRNA21后，可抑制腎臟的纖維化[31]。也有研究證實(shí)，miRNA21的表達(dá)是由Smad3調(diào)控的，Smad3的激活可以上調(diào)miRNA21的表達(dá)[29]。此外，miRNA21還可通過其他途徑促進(jìn)腎臟纖維化，包括：1）miRNA21可抑制腎臟過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorα，PPARα）的表達(dá)，干擾正常的脂質(zhì)代謝，引起腎臟脂質(zhì)沉積，繼而導(dǎo)致腎臟纖維化改變[31]；2）激活腎臟中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）復(fù)合物1（mTORC1），促進(jìn)纖維連接蛋白的表達(dá)，引起腎臟纖維化[32]。此外，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中發(fā)現(xiàn)，沉默miRNA21后，可改善小鼠的系膜擴(kuò)張、腎間質(zhì)纖維化及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，減少蛋白尿以及抑制腎臟的纖維化和炎性反應(yīng)基因的表達(dá)[33]。

miR29是另一個(gè)被廣泛研究的miRNAs，miR29家族中包括miR29a、miRNA29b和miR29c3個(gè)成員，其所有成員均具有相同的序列并且都可結(jié)合到相同的目標(biāo)基因，在臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)miRNA29具有抗纖維化作用，還可抑制TGF-β1的轉(zhuǎn)錄[34]。在正常腎臟和肺中miRNA29b的表達(dá)較高，但當(dāng)腎臟和肺發(fā)生纖維化改變時(shí)，miRNA29b的表達(dá)明顯降低[35-36]。在單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateralureteralobstruction，UUO）小鼠模型中，腎臟出現(xiàn)纖維化改變，同時(shí)miRNA29b的表達(dá)降低；而在敲除Smad3的UUO小鼠模型中，腎臟纖維化程度明顯減輕，miRNA29b的表達(dá)也明顯升高，因此Smad3可抑制miRNA29b的表達(dá)[36]。由于miRNA29b可直接作用于I/III/IV型膠原蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白的3′端非翻譯區(qū)，抑制其表達(dá)；在糖尿病腎病小鼠模型中，將db/db小鼠過表達(dá)miRNA29b后，其蛋白尿明顯減少，膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)減少，腎臟纖維化程度明顯減輕[37]。

因此，miRNA21及miRNA29b的表達(dá)與DN腎臟纖維化具有密切聯(lián)系，miRNA21及miRNA29b可作為治療DN的潛在靶點(diǎn)。在臺(tái)灣的DN患者中發(fā)現(xiàn)，其血清中的miRNA21含量明顯高于正常對(duì)照組，而miRNA29b含量明顯降低；隨著疾病的進(jìn)展，miRNA21的表達(dá)逐漸提高，miRNA29b的表達(dá)逐漸降低；所以血清中的miRNA21及miRNA29b的含量可作為DN的進(jìn)展期間的生物標(biāo)志物[38]。

糖腎方作為臨床上治療DKD的經(jīng)驗(yàn)方，課題組前期研究已經(jīng)證明其通過抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路改善STZ加單側(cè)腎切除大鼠腎臟纖維化[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予糖腎方干預(yù)12周后，db/db小鼠腎臟皮質(zhì)中Smad3的磷酸化程度降低，Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白及mRNA表達(dá)的下調(diào)，腎臟纖維化明顯減輕，表明糖腎方可減輕DN的腎臟纖維化保護(hù)腎臟功能。

綜上所述，糖腎方可抑制db/db小鼠腎臟TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的表達(dá)，可能通過下調(diào)miRNA21的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)miRNA29b的表達(dá)，顯著減輕腎臟纖維化進(jìn)展保護(hù)腎臟功能。

參考文獻(xiàn)

[1]BreyerMD，KretzlerM.Novelavenuesfordrugdiscoveryindiabetickidneydisease[J].ExpertOpinDrugDiscov，2018，13（1）：65.

[2]BolignanoD，CernaroV，GembilloG，etal.Antioxidantagentsfordelayingdiabetickidneydiseaseprogression：Asystematicreviewandmeta-analysis[J].PlosOne，2017，12（6）：e178699.

[3]SunJ，WangY，CuiW，etal.RoleofEpigeneticHistoneModificationsinDiabeticKidneyDiseaseInvolvingRenalFibrosis[J].JDiabetesRes，2017，2017（3）：7242384.

[4]HillsCE，AlrasheedN，AlrasheedN，etal.C-peptidereversesTGF-beta1-inducedchangesinrenalproximaltubularcells：implicationsfortreatmentofdiabeticnephropathy[J].AmericanJournalofPhysiologyRenalPhysiology，2009，296（3）：F614.

[5]ChungACK，LanHY.MicroRNAsinrenalfibrosis[J].FrontiersinPhysiology，2015，11（6）：474-482.

[6]MengX，TangPM，LiJ，etal.TGF-β/Smadsignalinginrenalfibrosis[J].FrontiersinPhysiology，2015，6：82.

[7]MarathePH，GaoHX，CloseKL.AmericanDiabetesAssociationStandardsofMedicalCareinDiabetes[J].JournalofDiabetes，2017，9（4）：320.

[8]SunH，LiQ，LiuY，etal.Xiao-Yao-San，AChineseMedicineFormula，AmelioratesChronicUnpredictableMildStressInducedPolycysticOvaryinRat[J].FrontiersinPhysiology，2017（8）：729.

[9]LiP，ChenY，LiuJ，etal.Efficacyandsafetyoftangshenformulaonpatientswithtype2diabetickidneydisease：amulticenterdouble-blindedrandomizedplacebo-controlledtrial[J].PLoSOne，2015，10（5）：e126027.

[10]LiP，ChenY，LiuJ，etal.EfficacyandSafetyofTangshenFormulaonPatientswithType2DiabeticKidneyDisease：AMulticenterDouble-BlindedRandomizedPlacebo-ControlledTrial[J].PlosOne，2015，10（5）：e126027.

[11]WangL，GaoP，ZhangM，etal.PrevalenceandEthnicPatternofDiabetesandPrediabetesinChinain2013，JAMA，2017，317（24）：2515.

[12]ChenSJ，YuanW，MoriY，etal.StimulationoftypeIcollagentranscriptioninhumanskinfibroblastsbyTGF-beta：involvementofSmad3[J].JournalofInvestigativeDermatology，1999，112（1）：49-57.

[13]VindevoghelL，LechleiderRJ，KonA，etal.SMAD3/4-DependentTranscriptionalActivationoftheHumanTypeVIICollagenGene（COL7A1）PromoterbyTransformingGrowthFactorβ[J].JournalofBiologicalChemistry，1998，95（25）：14769-14774.

[14]YuanW，VargaJ.TransformingGrowthFactor-βRepressionofMatrixMetalloproteinase-1inDermalFibroblastsInvolvesSmad3，JournalofBiologicalChemistry，2001，276（42）：38502.

[15]LiuZ，HuangXR，LanHY：Smad3mediatesANGII-inducedhypertensivekidneydiseaseinmice[J].AmericanJournalofPhysiologyRenalPhysiology，2012，302（8）：F986.

[16]ZhouL，F(xiàn)uP，HuangXR，etal.Mechanismofchronicaristolochicacidnephropathy：roleofSmad3[J].AmericanJournalofPhysiologyRenalPhysiology，2010，298（2）：F1006.

[17]SatoM，MuragakiY，SaikaS，etal.TargeteddisruptionofTGF-beta1/Smad3signalingprotectsagainstrenaltubulointerstitialfibrosisinducedbyunilateralureteralobstruction[J].JournalofClinicalInvestigation，2003，112（10）：1486.

[18]FujimotoM，MaezawaYK，JohK，etal.MicelackingSmad3areprotectedagainststreptozotocin-induceddiabeticglomerulopathy，Biochemical&BiophysicalResearchCommunications，2003，305（4）：1002.

[19]SamarakoonR，OverstreetJM，HigginsSP，etal.TGF-β1→SMAD/p53/USF2→PAI-1transcriptionalaxisinureteralobstruction-inducedrenalfibrosis[J].Cell&TissueResearch，2012，347（1）：117-128.

[20]MengXM，ChungACK，LanHY.RoleoftheTGF-β/BMP-7/Smadpathwaysinrenaldiseases，ClinicalScience，2013，124（4）：243.

[21]WuCF，ChiangWC，LaiCF，etal.Transforminggrowthfactorβ-1stimulatesprofibroticepithelialsignalingtoactivatepericyte-myofibroblasttransitioninobstructivekidneyfibrosis[J].AmericanJournalofPathology，2013，182（1）：118-131.

[22]LópezhernándezFJ，LópeznovoaJM.RoleofTGF-βinchronickidneydisease：anintegrationoftubular，glomerularandvasculareffects[J].Cell&TissueResearch，2012，347（1）：141-154.

[23]QiaoYC，ChenYL，PanYH，etal.Changesoftransforminggrowthfactorbeta1inpatientswithtype2diabetesanddiabeticnephropathy：APRISMA-compliantsystematicreviewandmeta-analysis[J].Medicine，2017，96（15）：e6583.

[24]TampeD，ZeisbergM.Potentialapproachestoreverseorrepairrenalfibrosis[J].NatureReviewsNephrology，2014，10（4）：226-237.

[25]SharmaK，IxJH，MathewAV，etal.Pirfenidonefordiabeticnephropathy[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyJasn，2011，22（6）：1144-1151.

[26]VincentiF，F(xiàn)ervenzaFC，CampbellKN，etal.APhase2，Double-Blind，Placebo-Controlled，RandomizedStudyofFresolimumabinPatientsWithSteroid-ResistantPrimaryFocalSegmentalGlomerulosclerosis，KidneyInternationalReports，2017，2（5）：800-810.

[27]ThumT，GrossC，F(xiàn)iedlerJ，etal.MicroRNA-21contributestomyocardialdiseasebystimulatingMAPkinasesignallinginfibroblasts[J].Nature，2008，456（7224）：980-984.

[28]WangJ，GaoY，MaM，etal.EffectofmiR-21onrenalfibrosisbyregulatingMMP-9andTIMP1inkk-aydiabeticnephropathymice[J].CellBiochemistry&Biophysics，2013，67（2）：537.

[29]ZhongX，ChungAC，ChenHY，etal.Smad3-mediatedupregulationofmiR-21promotesrenalfibrosis[J].J.Am.Soc.Nephrol，2011，22（9）：1668-1681.

[30]ZhongX，ChungACK，ChenHY，etal.miR-21isakeytherapeutictargetforrenalinjuryinamousemodeloftype2diabetes[J].Diabetologia，2013，56（3）：663-674.

[31]ChauBN，XinC，HartnerJ，etal.MicroRNA21promotesfibrosisofthekidneybysilencingmetabolicpathways[J].ScienceTranslationalMedicine，2012，4（121）：118r-121r.

[32]DeyN，DasF，MariappanMM，etal.MicroRNA-21orchestrateshighglucose-inducedsignalstoTORcomplex1，resultinginrenalcellpathologyindiabetes，JournalofBiologicalChemistry，2011，286（29）：25586-25603.

[33]KllingM，KaucsarT，SchauerteC，etal.TherapeuticmiR-21SilencingAmelioratesDiabeticKidneyDiseaseinMiceMolecularTherapy[J].theJournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy，2017，25（1）：165.

[34]KhellaHW，WhiteNM，F(xiàn)aragallaH，etal.ExploringtheroleofmiRNAsinrenalcellcarcinomaprogressionandmetastasisthroughbioinformaticandexperimentalanalyses[J].TumorBiology，2012，33（1）：131-140.

[35]XiaoJ，MengX，HuangXR，etal.miR-29InhibitsBleomycin-inducedPulmonaryFibrosisinMice[J].MolecularTherapy，2012，20（6）：1251-1260.

[36]QinW，ChungAC，HuangXR，etal.TGF-β/Smad3signalingpromotesrenalfibrosisbyinhibitingmiR-29[J].JournaloftheAmericanSocietyofNephrologyJasn，2011，22（8）：1462.

[37]ChenHY，ZhongX，HuangXR，etal.MicroRNA-29binhibitsdiabeticnephropathyindb/dbmice.MolecularTherapy[J].JournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy，2014，22（4）：842-853.

[38]ChienH，ChenC，ChiuY，etal.DifferentialmicroRNAProfilesPredictDiabeticNephropathyProgressioninTaiwan[J].InternationalJournalofMedicalSciences，2016，13（6）：457-465.

[39]ZhaoTT，SunSF，ZhangHJ，etal.TherapeuticEffectsofTangshenFormulaonDiabeticNephropathyinRats[J].PlosOne，2016，11（1）：e147693.

（2018-05-10收稿責(zé)任編輯：張文婷）