不同時間煎煮防風對防風散中有效成分含量及藥效學的影響

黃曉巍，李 鑫，吳月征，趙昕彤，葉豆丹，辛 國

（1.長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2.吉林省中藥生物大分子重點實驗室，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

防風散始載于《普濟方》[1]：“防風、連翹、山梔子、甘草各等分，治小兒傷寒及諸熱。兼治瘡痘入目生翳?！狈里L為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk的干燥根，性微溫、味辛甘，具有祛風解表、勝濕止痛等功效[2]。早于明代陶華所著《傷寒六書》中就有對防風入湯劑宜先煎的相關(guān)記載：“一用風病藥，先煎防風一二沸，后入余藥同煎”[3]，故認為防風入湯劑宜先煎，但在《中華人民共和國藥典》（2015版）[4]中并未對其做出明確闡述。本文現(xiàn)通過觀察防風先煎時間對防風散中的有效成分含量變化及藥效學的影響，明確防風散中防風先煎的最佳時間，為防風的特殊煎煮方法在臨床合理應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 ICR小鼠，SPF級，雌性180只，雄性60只，體質(zhì)量18～22 g，由長春億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供，許可證號：SCXK（吉）2016-0003。

1.2 藥物及試劑 升麻素苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號B21157；，5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號 B21823；防風Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk，安國市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司，批號160901； 連 翹Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl，河北祁一堂藥業(yè)有限公司，批號 1609017；梔子Gardenia jasminoides Ellis，河北祁一堂藥業(yè)有限公司，批號 1704027；炙甘草G.glabra Linn，安國市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司，批號160809。感冒疏風片，吉林龍鑫藥業(yè)有限公司，批號151008100；去痛片，長春大政藥業(yè)科技有限公司，批號161235；枸櫞酸噴托維林片，天津力生制藥股份有限公司，批號1611014.08。

1.3 儀器 島津高效液相色譜儀，十萬分之一天平，萬分之一分析天平，電熱恒溫鼓風干燥箱，超聲波清洗器，煎藥壺，恒溫水浴鍋，智能熱板儀，隔離濕氣超聲波霧化器。

2 化學試驗

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取防風有效成分標準品各5.00 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，稀釋成含升麻素苷0.06 mg/mL，5-O-甲基維斯阿米醇苷0.06 mg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱量防風50 g，加水500 mL浸泡30 min，另取連翹、梔子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，分別將防風先煎0、5、10、15、20、25、30、35、40 min，9個煎煮時間的防風散濃縮干燥（80 ℃）至干膏（出膏率約為16.5%）研磨成粉末（過3號篩），精密量取粉末0.25 g，置500 mL錐形瓶中，量取甲醇10 mL，放入瓶中，稱量總體質(zhì)量記錄，之后放在水浴上回流2 h，冷卻至室溫，稱量總體質(zhì)量與回流前對比，如果質(zhì)量有所減少，加入甲醇補足重量，濾紙過濾，取續(xù)濾液即得9種不同煎煮時間的防風供試品溶液。陰性對照組溶液的制備[5]，取連翹、梔子、甘草各50 g加1 000 mL水浸泡30 min，煎煮20 min，按上述方法制備即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：INERTSIL ODS-3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-水（40：60），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。在選定的色譜條件下，防風有效成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)與拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》（2015版）[4]要求。結(jié)果見圖1（插頁二）、圖2（插頁三）、圖3（插頁三）。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性考察 精密量取防風有效成分標準品各5.00 mg，分別放入2個5 mL容量瓶中，加入甲醇搖晃使其充分溶解，然后定容。以此液為母液，分別精密移取，制成濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL 2種標準品溶液，依2.3項下色譜條件進樣。以濃度 X（mg/mL） 為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，得出2種有效成分的回歸方程分別為：

結(jié)果表明，防風2種有效成分在濃度為0.1～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系[6]。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.1項下制備的對照品溶液10 μL，進行液相檢測，連續(xù)進樣6次。得到升麻素苷的RSD（n = 6）為0.71%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD（n = 6）為0.76%，結(jié)果表明，儀器精密度良好[7]。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 分別在 0、4、8、12、24、48 h精密吸取室溫下放置的2.2項下防風先煎10 min的樣品溶液10 μL，進樣測定。以峰面積積分值為指標測定其穩(wěn)定性，升麻素苷的RSD（n = 6）為 0.85%，5-O-甲基維斯阿米醇苷的RSD（n = 6）為 0.77%。表明防風散中的有效成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[8]。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗 按照2.2項下煎煮6份防風先煎10 min的防風散，并進行樣品處理，每份精密吸取10 μL進行檢測。以回歸方程計算升麻素苷含量平均值（n = 6）為5.686 mg/g，RSD（n = 6）為 1.08%。5-O-甲基維斯阿米醇苷含量平均值（n = 6）為 1.883 mg/g，RSD（n = 6）為 1.21%[9]。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知有效成分含量為5.638 、1.909 mg/g的防風先煎10 min防風散浸膏6份，每份約0.05 g，分別加入相當于樣品中2種主要成分含有量100%的對照品粉末，按2.2項下的方法制備供試品溶液。得到升麻素苷的回收率為100.4%，RSD（n = 6）為 1.21%。5-O-甲基維斯阿米醇苷的回收率為100.6%，RSD（n = 6）為 1.33%[10]。

2.4.6 樣品含量測定 分別吸取2.2項下9個煎煮時間的防風散，按照2.3項下色譜條件進樣10 μL測定[11]。9個樣品中防風2種有效成分的含量，見表1。

表1 不同煎煮時間防風2種有效成分的含量 mg/g

3 藥效學試驗與結(jié)果

現(xiàn)代研究[12-14]表明，防風散具有明顯鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛作用。故選擇鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛2個指標進行不同時間煎煮防風的防風散的藥效學實驗。

3.1 藥物制備 防風散的制備：稱取防風50 g，加500 mL水浸泡30 min，另取約連翹50 g，梔子50 g，甘草50 g加1 000 mL水浸泡30 min，依2.2項下時間要求進行煎煮，并濃縮至含防風濃度為1 g/mL，放涼，備用。

陽性藥物的制備：去痛片的制備，取藥品粉末11.150 g，用水50 mL制成濃度為0.230 g/mL溶液備用。枸櫞酸噴托維林片的制備，取藥品粉末0.570 g，加水50 mL制成濃度為0.011 4 g/mL溶液備用。感冒疏風片的制備，取藥品粉末40.00 g，加水50 mL，制成濃度為0.800 g/mL溶液備用。

3.2 動物分組及給藥 鎮(zhèn)痛實驗，120只雌鼠隨機分為12組，每組10只，即模型對照組，感冒疏風片組，去痛片組，不同煎煮時間的防風散9組（依2.2項下時間要求進行煎煮）及陰性對照組。鎮(zhèn)咳實驗120只鼠（雌雄各半）隨機分為12組，每組10只，即模型對照組，感冒疏風片組，枸櫞酸噴托維林片組及不同煎煮時間的防風散9組（依2.2項下時間要求進行煎煮）。按0.02 mL/g劑量對各組小鼠灌胃給藥，模型對照組給予等體積的純凈水，連續(xù)給藥7 d。

3.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果以均數(shù)±標準差（x± s ）表示，組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3.4 鎮(zhèn)咳實驗 各組小鼠（雌雄各半）末次給藥1 h后，將小鼠放入霧化器中，以25%氨水定量噴霧引咳，記錄各組小鼠的咳嗽潛伏期（首次咳嗽的時間）和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)[15-16]。

結(jié)果顯示，與模型對照組比較，感冒疏風片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01）；感冒疏風片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見表2。

3.5 鎮(zhèn)痛實驗 各組小鼠（雌性）末次給藥1 h后，將小鼠置于（55±0.5）℃的智能熱板儀上，記錄其足底接觸熱板到出現(xiàn)舔后足或跳躍的時間[17-18]。

結(jié)果顯示，與模型對照組相比，去痛片組、防風先煎10、15 min組小鼠的痛閾時間存在統(tǒng)計學意義（P＜0.01），感冒疏風片組、防風先煎5、20、25 min組的痛閾時間明顯延長（P＜0.05），見表3。

表2 不同時間煎煮防風的防風散對小鼠的鎮(zhèn)咳作用（x± s ，n = 10）

表3 不同時間煎煮防風的防風散對小鼠的鎮(zhèn)痛作用（x± s ，n = 10）

4 小結(jié)

HPLC檢測結(jié)果表明，防風散中的有效成分含量隨煎煮時間延長而逐漸增加，至防風煎煮30 min（即先煎10 min）時候含量最高，之后隨煎煮時間延長有效成分含量降低?？赡茉蛑饕獮椋弘S著煎煮時間改變，防風各有效成分之間可能產(chǎn)生分解反應、聚合反應等，也可能發(fā)生了有效成分之間的轉(zhuǎn)化。藥效學結(jié)果表明，與模型對照組相比，防風先煎10 min組小鼠的痛閾時間存在統(tǒng)計學意義（P＜0.01），防風先煎5、20、25 min組的痛閾時間明顯延長（P＜0.05）；防風先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），其中煎煮30 min組的鎮(zhèn)咳效果最為顯著；感冒疏風片組、枸櫞酸噴托維林片組、防風散防風先煎10、15、20、25 min組均可使小鼠咳嗽次數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01）。研究結(jié)果表明，防風散中防風有效成分的含量與防風的煎煮時間有關(guān)，且有效成分的含量變化直接影響了防風散的鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛的作用。綜上所述，防風入湯劑宜先煎，最佳煎煮時間為30 min（即先煎10 min）。