美沙拉嗪緩釋片單劑量與多劑量給藥在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究

向榮鳳 喻明潔 熊麗蓉 戴青 李曉宇 陳勇川

摘 要 目的：建立測定Beagle犬血漿中美沙拉嗪血藥濃度的方法，并用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定美沙拉嗪血藥濃度。血漿樣品加入水楊酸作為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)乙腈沉淀蛋白預(yù)處理；采用Inertsil ODS-3為色譜柱，乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）（85 ∶ 15，V/V）為流動相；以電噴霧離子源（負(fù)離子模式）檢測，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 152.0→107.9（美沙拉嗪）、m/z 137.0→92.9（內(nèi)標(biāo)）。取Beagle犬6只，單劑量（1.2 g）和多劑量（每天1.2 g，連續(xù)7 d）給予美沙拉嗪緩釋片，采集各時(shí)間點(diǎn)血樣，測定血漿中藥物濃度。采用DAS 3.3.1數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算不同給藥方式下的藥動學(xué)參數(shù)以及多劑量給藥后的蓄積因子（R），并采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)的組間比較。結(jié)果：美沙拉嗪血藥濃度在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 1），定量下限為0.1 μg/mL；批內(nèi)、批間精密度及基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)的RSD均小于11%；相對誤差（RE）為-0.75%～10.45%；提取回收率大于60%（RSD<5%）；穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD小于10%，RE在±15%范圍內(nèi)。單劑量、多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后，Beagle犬體內(nèi)美沙拉嗪的達(dá)峰濃度（cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）、滯留時(shí)間（MRT0-t）、滯留方差（VRT0-t）、清除率（CLz）、消除半衰期（t1/2z）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），多劑量給藥的R均值小于1.01。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確、快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究；單劑量和多劑量給藥后，美沙拉嗪在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征一致，且多劑量給藥未導(dǎo)致藥物蓄積現(xiàn)象的發(fā)生。

關(guān)鍵詞 美沙拉嗪緩釋片；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；Beagle犬；藥動學(xué)

中圖分類號 R969.1；R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2198-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the determination of mesalazine concentration in plasma of Beagle dogs， and to study the pharmacokinetics of Mesalazine sustained-release tablets in Beagle dogs. METHODS： HPLC-MS/MS method was used to determine the plasma concentration of mesalazine. Using salicylic acid as internal standard， after pre-treatment of acetonitrile precipitated protein， the determination was performed on Inertsil ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate （containing 0.2% formic acid） solution （85 ∶ 15，V/V）. ESI source （negative ion mode） detection was adopted in MRM mode， and the ion pair for quantity analysis were m/z 152.0→107.9 （mesalazine） and m/z 137.0→92.9 （internal standard）. Six Beagle dogs were selected and given single dose （1.2 g） and multiple dose （1.2 g each day， for consecutive 7 d） of Mesalazine sustained-release tablets. Blood sample was collected at different time points， and plasma concentration was determined. DAS 3.3.1 software was used to calculate pharmacokinetic parameters of different doses administration and accumulation factor （R） of multiple dose administration. Pharmacokinetic parameters were compared by using SPSS 16.0 software. RESULTS： The linear range of mesalazine concentration were 0.1-100 μg/mL （r=0.999 1）， and minimum quantification limit was 0.1 μg/mL. The RSDs of inter-batch and intra-batch precision and matrix effect were all less than 11%. Relative error （RE） of accuracy ranged -0.75%-10.45%； extraction recovery was higher than 60% （RSD<5%）. RSDs of stability tests were lower than 10%， and RE was within ±15%. After administration of single dose and multiple dose， there was no statistical significance in peak concentration （cmax）， peak time （tmax）， area under curve of plasma concentration-time curve （AUC0-t， AUC0-∞）， retention time （MRT0-t）， retention variance （VRT0-t）， clearance rate （CLz） or elimination half life （t1/2z） of mesalazine （P>0.05）. The R of multiple dose was less than 1.01. CONCLUSIONS： The method is accurate， rapid， sensitive and specific， which is suitable for pharmacokinetic study of Mesalazine sustained-release tablets in Beagle dogs. After single dose and multiple dose administration，mesalazine has same pharmacokinetic characteristics in Beagle dogs， but no drug accumulation is found.

KEYWORDS Mesalazine substained-release tablets； HPLC- MS/MS； Beagle dog； Pharmacokinetics

美沙拉嗪（Mesalazine）的化學(xué)名為5-氨基水楊酸，是一種用于治療炎性腸?。ㄈ鐫冃越Y(jié)腸炎、溫和的克羅恩病等）的抗炎藥，其主要是通過抑制白三烯、前列腺素E及自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎作用[1-2]。美沙拉嗪口服后能被迅速吸收，在腸腔及肝臟中主要經(jīng)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶代謝為產(chǎn)物N-乙酰-美沙拉嗪[3]。與其他同類藥物比較，美沙拉嗪結(jié)構(gòu)簡單、毒副作用小且長期用藥可降低潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌的發(fā)病率，因此近30年來一直被公認(rèn)為誘導(dǎo)緩解和維持緩解輕中度潰瘍性結(jié)腸炎的一線藥物[4]。但由于其普通制劑在口服后大部分經(jīng)上消化道吸收，僅少量藥物可到達(dá)結(jié)直腸，所以美沙拉嗪通常被制成能在回腸或結(jié)腸釋放的緩控釋制劑，以使其能在炎癥部位發(fā)揮更好的作用[5]。但由于輔料、pH值等制備工藝參數(shù)的差異，不同來源的美沙拉嗪緩控釋制劑的釋放行為也隨之不同，因此有必要對該藥的體內(nèi)藥動學(xué)特征進(jìn)行研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，美沙拉嗪血藥濃度的測定多采用高效液相色譜法（HPLC）[6-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[3，9-10]等；同時(shí)，國內(nèi)文獻(xiàn)僅報(bào)道了美沙拉嗪單劑量給藥后在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究[9]，而未見多劑量給藥后的藥動學(xué)研究報(bào)道?；诖?，本課題組以進(jìn)口美沙拉嗪緩釋片為試驗(yàn)藥物，建立測定Beagle犬血漿中美沙拉嗪血藥濃度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），并研究該制劑在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)特征，同時(shí)考察單劑量與多劑量給藥后的藥動學(xué)過程的差異，以及多劑量給藥后的藥物蓄積情況，以期為相關(guān)仿制制劑的結(jié)腸靶向效果評價(jià)及后續(xù)開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100 Series型HPLC儀（美國Agilent公司）；AB QTRAP2000型質(zhì)譜儀、Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)（美國AB Sciex公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；Biofuge primo R型低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；KDC-20型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)興股份有限公司中佳分公司）；GENIUS 3型旋渦混勻器（德國IKA公司）。

1.2 藥品與試劑

美沙拉嗪緩釋片（商品名：Lialda，美國Shire US公司，批號：WD084A，規(guī)格：1.2 g/片）；美沙拉嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100565-200701，純度：99.9%）；水楊酸對照品（內(nèi)標(biāo)，美國Alfa Aesar公司，批號：10154219，純度：99%）；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

Beagle犬6只，雌雄各半，體質(zhì)量9～12 kg，普通級[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0006]，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供；經(jīng)體檢證明健康，實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)期間未服用其他任何藥物，實(shí)驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）（85 ∶ 15，V/V）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（負(fù)離子模式），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；用于定量分析的離子對：m/z 152.0→107.9（美沙拉嗪）、m/z 137.0→92.9（內(nèi)標(biāo)）；離子源電壓：-4 500 V；離子源溫度：400 ℃；去簇電壓（DP）：-24.9 V/-27.0 V；碰撞能（CE）：-16.5 V/-22.0 V。美沙拉嗪和內(nèi)標(biāo)的二級質(zhì)譜子離子掃描圖見圖1。

2.2 溶液的制備

精密稱取美沙拉嗪對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的美沙拉嗪對照品貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇逐級稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為0.4、0.2、0.08、0.02、0.005、0.002、0.001 mg/mL的系列對照品溶液。另精密稱取水楊酸對照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的水楊酸對照品貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的水楊酸對照品溶液，即內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取待測血漿樣品200 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混勻0.5 min；加入乙腈600 μL，渦旋混勻2 min；13 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別取Beagle犬空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理（不加入內(nèi)標(biāo)），再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定；在上述空白血漿中加入一定質(zhì)量濃度的美沙拉嗪對照品溶液制成含藥血漿，同法預(yù)處理（需加入內(nèi)標(biāo)）并進(jìn)樣測定；取Beagle犬單劑量給藥后24 h時(shí)的血漿樣品200 μL，同法預(yù)處理（需加入內(nèi)標(biāo)）并進(jìn)樣測定。記錄上述樣品的典型MRM色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，美沙拉嗪和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為0.63、0.69 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾兩者的測定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與定量下限的考察 取空白血漿180 μL，分別加入質(zhì)量濃度為1.0、0.4、0.2、0.08、0.02、0.005、0.002、0.001 mg/mL的美沙拉嗪對照品溶液20 μL，混勻，制得含美沙拉嗪分別為100、40、20、8、2、0.5、0.2、0.1 μg/mL的系列含藥血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、待測物峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ar）之比（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.206c+0.003 08（r=0.999 1）。另同法配制含美沙拉嗪0.1 μg/mL的血漿樣品，平行制備5份，預(yù)處理后進(jìn)樣測定，結(jié)果血藥濃度的RSD為13.03%（n=5）。結(jié)果表明，美沙拉嗪血藥濃度在0.1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，本方法定量下限為0.1 μg/mL。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制高、中、低、定量下限4個(gè)質(zhì)量濃度（80、8、0.2、0.1 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，均平行5個(gè)樣本分析，同法預(yù)處理后在同一個(gè)分析批內(nèi)進(jìn)樣測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，考察本方法的批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度[以相對誤差（RE）表示，下同]；同法連續(xù)3 d進(jìn)樣測定，分別代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，考察本方法的批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間RSD均小于11%，RE為-0.75%～10.45%，詳見表1。

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（80、8、0.2 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，均平行5個(gè)樣本分析，同法預(yù)處理后進(jìn)樣測定；另配制同樣質(zhì)量濃度的美沙拉嗪對照品水溶液，均平行5個(gè)樣本分析，同法預(yù)處理后進(jìn)樣測定。根據(jù)測得的血漿中美沙拉嗪峰面積與對應(yīng)水溶液中美沙拉嗪峰面積之比計(jì)算其提取回收率。結(jié)果顯示，提取回收率均大于60%，RSD均小于5%，詳見表2。

2.4.5 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 分別取6只Beagle犬空白血漿200 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，取上清液作為溶劑，配制含美沙拉嗪0.2 μg/mL的溶液，進(jìn)樣測定，得峰面積（A基質(zhì)）；另配制含美沙拉嗪0.2 μg/mL的甲醇溶液，進(jìn)樣測定，得峰面積（A標(biāo)準(zhǔn)）；按公式（A基質(zhì)/A標(biāo)準(zhǔn)×100%）計(jì)算得基質(zhì)效應(yīng)因子（MF）。同法操作并測得內(nèi)標(biāo)的MF。結(jié)果顯示，以美沙拉嗪與內(nèi)標(biāo)的MF比值計(jì)算得內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子為（101.74±8.54）%，RSD為8.39%（n=6），表明在本實(shí)驗(yàn)色譜與質(zhì)譜條件下可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度（80、8、0.2 μg/mL）的美沙拉嗪血漿樣品，考察其于室溫放置3 h、反復(fù)凍融（-70 ℃至室溫）3次、-70 ℃冷凍6周以及經(jīng)預(yù)處理后室溫放置16 h的穩(wěn)定性，均平行3個(gè)樣本分析。結(jié)果顯示，所有條件下樣品血藥濃度實(shí)測值的RSD均小于10%（n=3），實(shí)測值與理論值的RE均在±15%范圍內(nèi)，表明美沙拉嗪血漿樣品穩(wěn)定性良好，詳見表3。

2.5 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.5.1 單劑量給藥實(shí)驗(yàn) 取6只Beagle犬，于實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水過夜（≥10 h）。次日早晨將美沙拉嗪緩釋片1片置于犬舌后部（1.2 g/只），喂水20 mL并確認(rèn)藥片已被吞下后，將犬放入籠中。于給藥前（0 h）及給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、24、32、48 h時(shí)，分別自每只犬前肢頭靜脈取血2 mL，置于肝素化試管中，3 000 r/min離心5 min，取血漿于-70 ℃保存，待測。

2.5.2 多劑量給藥實(shí)驗(yàn) 單劑量給藥結(jié)束2周后，對6只Beagle犬禁食不禁水過夜（≥10 h），于次日早晨按“2.5.1”項(xiàng)下給藥方法，給予美沙拉嗪緩釋片1片，qd，連續(xù)給藥7 d。于第5、6、7天給藥前及第7天給藥后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、24、32、48 h時(shí)，分別自每只犬前肢頭靜脈取血2 mL，置于肝素化試管中，3 000 r/min離心5 min，取血漿于-70 ℃保存，待測。

2.5.3 血藥濃度-時(shí)間曲線繪制 取6只Beagle犬單劑量和多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后的血漿樣品，采用“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，并繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線，詳見圖3。

2.5.4 藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算 采用DAS 3.3.1數(shù)據(jù)處理軟件對單劑量與多劑量給藥后美沙拉嗪血藥濃度的實(shí)測值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4；同時(shí)，采用SPSS 16.0軟件對單劑量與多劑量給藥后的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，單劑量與多劑量給藥的達(dá)峰濃度（cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0-t、AUC0-∞）、滯留時(shí)間（MRT0-t）、滯留方差（VRT0-t）、清除率（CL）、消除半衰期（t1/2z）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明單劑量與多劑量給藥后美沙拉嗪在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)未發(fā)生明顯變化。

2.5.5 多劑量給藥后Beagle犬體內(nèi)的藥物蓄積評價(jià) 采用DAS 3.3.1數(shù)據(jù)處理軟件分別對6只Beagle犬的單劑量給藥后的藥動學(xué)參數(shù)cmax、AUC0-t和多劑量給藥后的藥動學(xué)參數(shù)AUCss、穩(wěn)態(tài)cmax（cmaxss，即表4中的cmax，為最后一次給藥后的達(dá)峰濃度）進(jìn)行計(jì)算，并按公式（Rcmax=cmaxss/cmax；RAUC=AUCss/AUC0-t[11]）計(jì)算多劑量給藥后美沙拉嗪在Beagle犬體內(nèi)的蓄積因子（R），結(jié)果見表5。由表5可見，多劑量給藥后美沙拉嗪的Rcmax、RAUC均值均小于1.01，表明美沙拉嗪多劑量給藥在Beagle犬體內(nèi)未發(fā)生藥物蓄積現(xiàn)象[11]。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了測定Beagle 犬血漿中美沙拉嗪濃度的HPLC-MS/MS方法，并對該方法進(jìn)行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，所建方法適用于美沙拉嗪緩釋片在Beagle犬體內(nèi)的藥動學(xué)研究。本研究單劑量給藥后藥動學(xué)參數(shù)與已有文獻(xiàn)結(jié)果[9]比較后顯示，t1/2z較為一致，但tmax、cmax、AUC等參數(shù)存在差異?？紤]其主要原因一是由于犬個(gè)體間差異，二是由于實(shí)驗(yàn)用制劑的廠家工藝不同。本實(shí)驗(yàn)選用的試驗(yàn)藥物為進(jìn)口制劑，緩釋性能良好，因此tmax較國產(chǎn)制劑明顯延長，cmax相對較低，AUC相對較高。

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6只Beagle犬單劑量與多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后cmax和AUC0-t的RSD均大于50%，表明Beagle犬的藥動學(xué)參數(shù)個(gè)體差異較大。分析其原因，可能是因?yàn)槊郎忱壕忈屍鳛橐环N在回腸末端釋放的局部抗炎制劑，在結(jié)腸部位的停留時(shí)間相對較短，藥物的吸收容易受結(jié)腸的排空時(shí)間和結(jié)腸內(nèi)容物的干燥程度所影響。

此外，6只Beagle犬單劑量與多劑量給予美沙拉嗪緩釋片后主要的藥動學(xué)參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明多劑量給藥對其體內(nèi)藥動學(xué)過程無明顯影響；蓄積因子Rcmax為1.00±0.16，RAUC為0.88±0.15，表明美沙拉嗪緩釋片多劑量給藥后在犬體內(nèi)不產(chǎn)生藥物蓄積。然而，由于Beagle犬與人體胃腸道的生理學(xué)差異，使得兩者對該制劑的釋放和吸收行為有所不同，因此有待于對該制劑在人體內(nèi)的藥動學(xué)行為作進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-01-29 修回日期：2018-07-02）

（編輯：段思怡）