鹽酸小檗胺片溶出度測定方法的建立及其體外溶出性能評價

董寧 劉慧穎 孫立新

中圖分類號 R927.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2356-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.12

摘 要 目的：建立鹽酸小檗胺片溶出度的測定方法，評價5家企業(yè)樣品的批內(nèi)質(zhì)量。方法：采用高效液相色譜法測定鹽酸小檗胺濃度并計算累積溶出度。色譜柱為Agilent C18，流動相為0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶液（含0.2%三乙胺，磷酸調(diào)pH至6.8）-乙腈（60 ∶ 40，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為282 nm，柱溫為35 ℃，進樣量為40 μL。采用槳法，以累積溶出度為指標，篩選溶出介質(zhì)（水、pH 5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液）和轉(zhuǎn)速（50、75 r/min），確定溶出度測定的條件。繪制5家企業(yè)樣品的溶出曲線，比較批內(nèi)均一性。結(jié)果：鹽酸小檗胺檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.96～257.40 μg/mL（r=0.999 9），精密度、穩(wěn)定性（8 h）、重復(fù)性、耐用性試驗的RSD均<2.0%（n=5或n=6），平均回收率為98.6%（RSD=1.64%，n=9）。在3種溶出介質(zhì)及2種轉(zhuǎn)速下藥物累積溶出度無明顯差異，最終確定水為溶出介質(zhì)、轉(zhuǎn)速為50 r/min。在5家企業(yè)樣品中，只有1家企業(yè)的樣品批內(nèi)均一性較好。結(jié)論：所建立的溶出度測定方法簡便易行、準確度高，可用于鹽酸小檗胺片中鹽酸小檗胺的溶出度測定；部分企業(yè)需進一步提高藥品質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 鹽酸小檗胺片；槳法；溶出度；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for determining the dissolution of Berbamine hydrochloride tablets， and to evaluate the intra-batch quality of samples from 5 enterprises. METHODS： The concentration of berbamine hydrochloride was determined by HPLC and accumulative dissolution was calculated. The determination was performed on Agilent C18 column with mobile phase consisted of 0.02 mol/L dipotassium hydrogen phosphate solution （containing 0.2% triethylamine， pH adjusted to 6.8 with phosphoric acid）-acetonitrile （60 ∶ 40， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 282 nm. The column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 40 μL. With paddle method， using accumulative dissolution as index， the medium（water，pH 5.5 acetic acid-sodium acetate buffer solution，pH 6.8 phosphate buffer solution）and rotation speed（50，75 r/min） were selected to establish the determination condition of dissolution. The dissolution curves of 5 enterprises were drawn to compare the intra-batch uniformity of samples. RESULTS： The linear range of berbamine hydrochloride were 3.96-257.40 μg/mL （r=0.999 9）. RSDs of precision， stability （8 h）， reproducibility and durability tests were all lower than 2.0% （n=5 or n=6）. The average recoveries were 98.6% （RSD=1.64%， n=9）. The accumulative dissolution of samples in 3 kinds of mediums at 2 kinds of rotation speeds had no obvious differences. The optimal determination condition was water as medium at rotation speed of 50 r/min. Of all the five enterprises， intra-batch uniformity of sample was satisfied in only on enterprise. CONCLUSIONS： Established method is simple， feasible and accurate， and it can be used to determine the dissolution of berbamine hydrochloride in Berbamine hydrochloride tablets. Some enterprises should make further efforts to improve the quality of medicines.

KEYWORDS Berbamine hydrochloride tablets； Paddle method； Dissolution； HPLC

小檗胺是從小檗科小檗屬植物細葉小檗等中草藥植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿[1]，分子式為C37H40N2O6，藥用其鹽酸鹽，為鈣調(diào)素拮抗藥，其制劑為鹽酸小檗胺片。小檗胺為天然提取物，藥理作用廣泛、不良反應(yīng)小、長期毒性低[2]，為促進白細胞增生藥；此外，還具有增強機體免疫力、抗結(jié)核、擴張血管、抗心肌缺氧缺血、抗心律失常等作用，主要用于各種原因引起的白細胞減少癥，亦可用于預(yù)防癌癥放療、化療后白細胞減少[3]。

鹽酸小檗胺片的質(zhì)量標準收載于國家藥品標準化學(xué)藥品地方標準上升國家標準第十三冊[3]，現(xiàn)有質(zhì)量標準未對溶出度進行控制，無法評價該藥物體外溶出情況。鑒于此，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法測定鹽酸小檗胺片溶出度的方法[4-6]，并對5家企業(yè)的樣品批內(nèi)均一性進行了評價。

1 材料

1.1 儀器

1200 HPLC儀，配備紫外檢測器（美國Agilent公司）；2487HPLC儀，配備二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；XP205天平（瑞士Mettler -Toledo公司）；Orion 3-Star酸度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；RCZ-8M溶出試驗儀，配備RZQ-8D取樣收集系統(tǒng)（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸小檗胺片：企業(yè)A（薄膜衣片，批號：100101）、企業(yè)B（糖衣片，批號：100602）、企業(yè)C（糖衣片，批號：100101）、企業(yè)D（素片，批號：20100801）、企業(yè)E（糖衣片，批號：10072331），規(guī)格均為28 mg/片（相當(dāng)于含小檗胺25 mg）；鹽酸小檗胺對照品（北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司，批號：160113，純度：≥98%）；鹽酸小檗胺原料（企業(yè)A）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 溶出度方法的建立

2.1 溶出度測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol/L磷酸氫二鉀溶液（含0.2%三乙胺，磷酸調(diào)pH至6.8）-乙腈（60 ∶ 40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：282 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：40 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）對照品溶液。取鹽酸小檗胺對照品約10 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。（2）供試品溶液。取企業(yè)C樣品，研細，混勻，精密稱取147.52 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）空白溶液。取處方成分較多的企業(yè)C的輔料，按處方比例制成空白溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，鹽酸小檗胺峰和相鄰雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。輔料對鹽酸小檗胺的測定無干擾，理論板數(shù)以鹽酸小檗胺峰計> 3 000，色譜圖詳見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取鹽酸小檗胺對照品約25 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品溶液。精密量取上述對照品溶液0.04 、0.18、0.26、1.40、1.70、2.00、2.30、2.60 mL，分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各40 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鹽酸小檗胺質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=5 112.6x-1.118 9（r=0.999 9）。結(jié)果表明，鹽酸小檗胺檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.96～257.40 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取企業(yè)A供試品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗胺峰面積的RSD為0.10%（n=6），表明本方法的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取按企業(yè)A提供的處方混勻的原料和輔料，約65 mg，共6份，精密稱定，分別置于200 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取上述供試品溶液各40 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，鹽酸小檗胺的平均標示含量為99.2%（RSD=0.67%，n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.6”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗胺峰面積的RSD為0.13%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 回收率試驗 取企業(yè)A處方量輔料約44 mg，置于100 mL量瓶中，共9份，分別按照80%、100%、120%的比例加入鹽酸小檗胺原料適量，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取上述供試品溶液各40 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果，樣品平均回收率為98.6%（RSD=1.64%，n=9），表明本方法準確度良好。

2.1.9 耐用性試驗 取企業(yè)A 45 min溶出度樣品一份，分別采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Dikma C18（250 mm×4.6mm，5 μm）和Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，按“2.1”項下方法測定溶出度。結(jié)果，3個品牌色譜柱測定的溶出度的RSD為0.52%（n=3），表明本方法耐用性良好。

2.2 溶出度測定裝置的確定

槳法是片劑的首選溶出方法[7]，且5家企業(yè)的鹽酸小檗胺片在溶出介質(zhì)中均無上浮現(xiàn)象，故本研究采用槳法進行測定。

2.3 溶出度測定轉(zhuǎn)速的確定

以水為溶出介質(zhì)進行片劑溶出度測定，轉(zhuǎn)速分別選擇50、75 r/min，按“2.1”項下方法操作。結(jié)果，鹽酸小檗胺片累積溶出度在2種轉(zhuǎn)速下無明顯差異，以簡單方便為原則，故本研究選擇轉(zhuǎn)速為50 r/min。

2.4 溶出介質(zhì)的確定

2.4.1 溶出介質(zhì)種類的確定 分別以水、pH 5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液（取醋酸鈉5.98 g，加2 mol/L醋酸溶液3 mL，加水稀釋至600 mL）和pH 6.8磷酸鹽緩沖液[同2015年版《中國藥典》（四部）通則8004 緩沖液][8]為溶出介質(zhì)，分別于0、5、10、15、20、30、45、60 min取樣10 mL，過濾，同時補充等溫同體積的溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液40 μL，測定，計算累積溶出度，繪制溶出曲線，見圖2。

由圖2可見，鹽酸小檗胺片在3種溶出介質(zhì)中的溶出行為沒有明顯差異，以簡單方便為原則，故本研究選擇水為溶出介質(zhì)。

2.4.2 溶出介質(zhì)體積的確定 槳法溶出體積的范圍一般為500～1 000 mL。鹽酸小檗胺的紫外吸收較弱，為保證定量濃度的準確性，故降低介質(zhì)體積以提高待測濃度，最終采用較常見的600 mL作為體積值。

2.5 溶出時間的確定

取各企業(yè)鹽酸小檗胺片樣品各1批，每批6片，分別放入溶出杯中，以水600 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為50 r/min，于0、5、10、15、20、30、45、60 min時取樣10 mL，過濾，同時補充等溫同體積的溶出介質(zhì)。取續(xù)濾液40 μL測定，計算各時間點的累積溶出度，繪制溶出曲線，結(jié)果見表1、圖3。

根據(jù)溶出行為，取樣時間應(yīng)設(shè)定為溶出最大值減5%的時間。由表1、圖3可知，除企業(yè)C外，其余企業(yè)樣品均在45 min以內(nèi)達到溶出平衡，故可設(shè)定溶出取樣時間為45 min。

2.6 溶出度限度的確定

5家企業(yè)鹽酸小檗胺片在達到溶出平衡時累積溶出度均大于95%，按累積溶出度最大值減15%確定為限度，即限度為80%。

2.7 批內(nèi)均一性評價

按“2.5”項下操作，選取每個生產(chǎn)企業(yè)各1個批號，1次試驗6片，以各點累積溶出度的精密度為指標，比較批內(nèi)均一性，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，企業(yè)A樣品5 min時累積溶出度的RSD為10%（應(yīng)在20%以內(nèi)），10、15、20、30、45、60 min累積溶出度的RSD分別為8%、5%、4%、3%、4%、3%（各點應(yīng)在10%以內(nèi)），均一性較好，其余企業(yè)樣品批內(nèi)均一性均較差。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

現(xiàn)行鹽酸小檗胺片的質(zhì)量標準未控制溶出度，而采用高氯酸非水滴定測定含量的方法易引入汞污染，故筆者采用HPLC法測定溶出度，并對方法進行驗證。取鹽酸小檗胺對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果鹽酸小檗胺在282 nm波長處有最大吸收，故檢測波長選定為282 nm。本文分別考察了鹽酸小檗胺在乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液系統(tǒng)、乙腈-磷酸二氫鉀溶液-離子對試劑系統(tǒng)和乙腈-磷酸氫二鉀-三乙胺系統(tǒng)的色譜行為，結(jié)果后兩者能滿足色譜系統(tǒng)定量和分離度要求，考慮到離子對試劑對色譜柱的不可逆?zhèn)?，故最終選擇乙腈-磷酸氫二鉀-三乙胺系統(tǒng)作為該制劑的溶出度測定方法的流動相。

3.2 關(guān)于對照品的質(zhì)量

中國食品藥品檢定研究院目前尚無法提供鹽酸小檗胺國家對照品，鑒于試驗要求，筆者采用了北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司的對照品，其HPLC純度≥98%。因?qū)φ掌窋?shù)量有限，筆者未對干燥失重、殘留溶劑、熾灼殘渣等進行進一步測定和標化，故按此純度計算的溶出度結(jié)果可能存在2%～3%的偏差。該偏差對整體數(shù)據(jù)的影響是同向一致的，對溶出曲線的趨向的影響是可忽略的，故并不影響對整體結(jié)果的評價。

3.3 溶出介質(zhì)的考察

本文在篩選溶出介質(zhì)時，同時試驗了該制劑在0.1 mol/L鹽酸中的溶出情況。因樣品直接進樣（溶劑為0.1 mol/L鹽酸）后與堿性流動相發(fā)生了中和反應(yīng)，使得樣品在液相色譜中的分析形態(tài)發(fā)生了變化，無法有效定量，故未繪制該介質(zhì)中的溶出曲線。

3.4 結(jié)果分析

從5家企業(yè)鹽酸小檗胺片的均一性曲線可知，除企業(yè)A外，其余各家樣品均一性均較差，提示其余企業(yè)該制劑工藝尚有待提高。包糖衣的企業(yè)B、C和E 3家企業(yè)的該片劑溶出均有滯后現(xiàn)象，其中企業(yè)C的有效溶出開始時間約為20 min，即溶出較慢，可能會影響該藥在體內(nèi)的起效時間，且其溶出曲線記錄至60 min時，仍未達到溶出平衡，該企業(yè)應(yīng)對此關(guān)注。

3.5 研究意義

現(xiàn)行鹽酸小檗胺片的質(zhì)量標準尚不完善，對崩解時間進行檢查無法評價小檗胺片的溶散速率和程度。前期調(diào)研顯示，生產(chǎn)企業(yè)未對產(chǎn)品的工藝和輔料的來源等做深入研究，造成產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。本文建立的溶出度方法可作為企業(yè)提升標準的參考，也可為該制劑質(zhì)量標準的修訂及企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的橫向比較提供依據(jù)。

參考文獻

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（收稿日期：2018-04-28 修回日期：2018-06-27）

（編輯：余慶華）