MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與陜西地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生的相關(guān)性研究

白曉丹 趙超 劉琳娜

摘 要 目的：探討5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因多態(tài)性與陜西地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)生的相關(guān)性。方法：選取2016年11月—2017年5月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診的陜西地區(qū)漢族冠心病患者350例，作為病例組；選取同期于該院行體檢的陜西地區(qū)漢族健康受試者347例，作為對照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)法檢測各受試者MTHFR基因C677T、A1298C位點以及MTRR基因A66G位點的基因型，比較兩組受試者各基因型及等位基因分布的差異，考察其基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果：共檢出MTHFR基因C677T位點CC、CT、TT型，MTHFR基因A1298C位點AA、AC、CC型，MTRR基因A66G位點AA、AG、GG型等基因型。其中，對照組受試者C677T位點CC、CT、TT型分布頻率分別為26.80%、44.96%、28.24%，A1298C位點AA、AC、CC型分布頻率分別為71.18%、24.78%、4.04%，A66G位點AA、AG、GG型分布頻率分別為54.47%、38.62%、6.91%；病例組受試者C677T位點CC、CT、TT型分布頻率分別為15.43%、49.71%、34.86%，A1298C位點AA、AC、CC型分布頻率分別為77.14%、21.71%、1.15%，A66G位點AA、AG、GG型分布頻率分別為54.57%、38.29%、7.14%。兩組受試者各基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。兩組受試者C677T、A1298C位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中對照組受試者C677T位點CC型分布頻率及C等位基因頻率、A1298C位點CC型分布頻率及C等位基因頻率均顯著高于病例組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。兩組受試者A66G位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：陜西地區(qū)漢族人群MTHFR基因C677T位點以突變型居多，A1298C位點以野生型居多；上述兩個位點的多態(tài)性可能與該類人群冠心病的發(fā)生有關(guān)，其中C677T位點突變可能是冠心病發(fā)生的危險因素之一，A1298C位點突變則可能是有益因素。而MTRR基因A66G位點多態(tài)性可能與該類人群冠心病的發(fā)生無關(guān)。

關(guān)鍵詞 陜西地區(qū)；漢族；5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因；甲硫氨酸合成酶還原酶基因；C677T；A1298C；A66G；基因多態(tài)性；冠心??；相關(guān)性

中圖分類號 R968；R541.4 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3125-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.22

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the correlation of gene polymorphism of MTHFR and MTRR with the occurrence of coronary heart disease in Han population in Shaanxi area. METHODS： Totally 350 Shaanxi Han patients with coronary heart disease were selected from cardiovascular department of the Second Affiliated Hospital of Air Force Medical University during Nov. 2016-May 2017 as case group. Totally 347 Shaanxi Han healthy volunteers were selected from the hospital in the same period as control group. The genotypes of MTHFR gene C677T， A1298C site and MTRR gene A66G site were detected by PCR assay. The genotype and allelic distribution were compared between 2 groups. The relationship between gene polymorphism and the occurrence of coronary heart disease was investigated. RESULTS： CC， CT and TT genotype in MTHFR gene C677T site， AA， AC and CC genotype in MTHFR gene A1298C site as well as AA， AG， GG genotype in MTRR gene A66G site were detected. In control group， the frequencies of CC， CT and TT genotype in C677T site were 26.80%， 44.96%， 28.24%； the frequencies of AA， AC and CC genotype in A1298C site were 71.18%， 24.78%， 4.04%； and the frequencies of AA， AG and GG genotype in A66G site were 54.47%， 38.62%， 6.91%， respectively. In case group， the frequencies of CC， CT and TT genotype in C677T site were 15.43%， 49.71%， 34.86%； the frequencies of AA， AC and CC genotype in A1298C site were 77.14%， 21.71%， 1.15%； and the frequencies of AA， AG and GG genotype in A66G site were 54.57%， 38.29%， 7.14%， respectively. The frequencies of genotype distribution in 2 groups were all in line with the Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）. There was statistical significance in genotype distribution frenquencies and allele frequencies in C677T and A1298C site between 2 groups （P<0.05）. The frequencies of CC genotype distribution and C allele in C677T site， the frequencies of CC genotype distribution and C allele in A1298C site in control group were significantly higher than case group， with statistical significance （P<0.05）. There was no statistical significance in genotype distribution frequencies or allele frequencies in A66G site between 2 groups （P>0.05）. CONCLUSIONS： MTHFR gene is mainly mutant type in C677T site and wild type in A1298C site among Han population in Shaanxi area. Gene polymorphism of above two sites may be associated with the occurrence of coronary heart disease； C677T site mutation may be a risk factor for coronary heart disease， while A1298C site mutation may be a beneficial factor. MTRR gene polymorphism in A66G site maybe has no relationship with coronary heart disease in the population.

KEYWORDS Shaanxi area； Han population； MTHFR gene； MTRR gene； C677T；A1298C；A66G；Gene polymorphism； Coronary heart disease； Relationship

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）是甲硫氨酸-葉酸代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，在維持葉酸正常代謝的過程中具有重要作用[1]。MTHFR基因C677T、A1298C位點以及MTRR基因A66G位點的多態(tài)性會影響MTHFR和MTRR酶的活性，造成機體葉酸代謝異常[2-3]，而葉酸代謝異?？蛇M一步導(dǎo)致同型半胱氨酸（Hcy）水平升高，后者與冠心病的發(fā)生密切相關(guān)[4]；同時，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點多態(tài)性是早發(fā)冠心病的危險因素，可作為該疾病的獨立預(yù)測因子[5-6]。目前，臨床對MTHFR和MTRR基因位點突變與冠心病發(fā)生的相關(guān)性研究較少，且不同種族和地區(qū)人群相關(guān)基因的多態(tài)性分布也存在一定差異[7-8]。為此，本研究對陜西地區(qū)漢族人群MTHFR和MTRR基因的多態(tài)性進行檢測，初步探討其與該類人群冠心病發(fā)生的相關(guān)性，以期為當?shù)毓谛牟》乐渭叭~酸等補充治療提供參考。

1 材料

7500型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；5452型離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑：6 cm）；MX-S型渦旋振蕩儀（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；HH-1A型水浴鍋（常州萬合儀器制造有限公司）。

DNA提取試劑（批號：20160802、20170209，含蛋白酶K、緩沖液BL、活化液BH1、活化液BH2、緩沖液BW1、緩沖液BW2、洗脫液BE）、吸附柱均由上海百傲科技股份有限公司提供；PCR擴增試劑（批號：20160523、20161217，含反應(yīng)預(yù)混液1、反應(yīng)預(yù)混液2、聚合酶預(yù)混液、質(zhì)控品1和質(zhì)控品2）由陜西佰美基因股份有限公司提供；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 資料與方法

2.1 研究對象

選取2016年11月-2017年5月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診的冠心病患者為病例組。納入標準：（1）符合1979年世界衛(wèi)生組織（WHO）修訂的冠心病診斷標準[9]；（2）漢族；（3）陜西地區(qū)常住人口。排除標準：（1）預(yù)計生存期短于1年者；（2）嚴重?zé)熅剖群谜?；?）伴有甲狀腺功能異常及其他代謝相關(guān)性疾病者。

選取同期于該院行體檢的健康者為對照組。納入標準：（1）無冠心病及其他心腦血管疾病；（2）漢族；（3）陜西地區(qū)常住人口。排除標準：（1）嚴重?zé)熅剖群谜?；?）有甲狀腺功能異常及其他代謝相關(guān)性疾病者。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。因本研究對受試者幾乎沒有風(fēng)險，故豁免了其知情同意。

2.2 血樣采集

采集所有受試者的外周靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，于-20 ℃下冷凍保存，備用。

2.3 DNA提取與擴增

2.3.1 吸附柱活化 向吸附柱中加入活化液BH1 500 μL，靜置2～3 min，以12 000 r/min離心30 s后，棄去上清液；隨后加入活化液BH2 500 μL，以12 000 r/min離心30 s后，棄去上清液，即得活化后的吸附柱，備用。

2.3.2 DNA提取 向離心管中依次加入蛋白酶K 20 ?L、經(jīng)EDTA抗凝的全血樣品200 ?L，加入緩沖液BL（pH=6）200 ?L，渦旋振蕩15 s、低速離心（轉(zhuǎn)速：7 000～8 000 r/min，下同）7～8 s后，置于56 ℃水浴鍋中加熱10 min以裂解細胞。取出離心管，冷卻至室溫后，加入無水乙醇200 ?L，充分混勻，渦旋振蕩15 s、低速離心7～8 s。取上清液至已活化的吸附柱中，以12 000 r/min離心1 min后，依次加入緩沖液BW1、BW2（pH均為6）各500 ?L，以12 000 r/min離心1 min；取出吸附柱，置于另一離心管中，開蓋揮發(fā)溶劑2～3 min，加入洗脫液BE 60 ?L，于56 ℃水浴鍋中加熱5 min后，以12 000 r/min離心1 min，留取上清液，即得受試者DNA樣品，備用。

2.3.3 DNA擴增 采用PCR法。引物由陜西佰美基因股份有限公司設(shè)計并合成。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)預(yù)混液1和反應(yīng)預(yù)混液2各14.75 ?L（上述預(yù)混液中含有位點特異性引物、內(nèi)標引物、熒光探針、dNTPs、緩沖溶液等）、聚合酶預(yù)混液0.25 ?L（含DNA聚合酶）、DNA模板5 ?L（質(zhì)控品反應(yīng)體系則對應(yīng)加入相同劑量的質(zhì)控品，不加DNA模板）。擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，共40個循環(huán)。嚴格按照PCR擴增試劑說明書操作。

2.3.4 結(jié)果判定 參考文獻[10-11]，分別根據(jù)各位點反應(yīng)體系兩個孔道檢測信號的循環(huán)閾值（Ct）的差值進行檢測結(jié)果判定：若兩個孔道均正常擴增，其差值的絕對值小于3，則樣本為突變雜合型；若只有加入反應(yīng)預(yù)混液1的孔道正常擴增，或兩個孔道均正常擴增且加入反應(yīng)預(yù)混液2孔道的Ct值與加入反應(yīng)預(yù)混液1孔道的Ct值的差值大于3，則樣本為野生純合型；若只有加入反應(yīng)預(yù)混液2的孔道正常擴增，或兩個孔道均正常擴增且加入反應(yīng)預(yù)混液1孔道的Ct值與加入反應(yīng)預(yù)混液2孔道的Ct值的差值大于3，則樣本為突變純合型。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗考察受試者基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（HWE）。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組受試者的基本資料

對照組共納入健康者347例，其中男性209例、女性138例，平均年齡（61±14）歲；病例組共納入冠心病患者350例，其中男性255例、女性95例，平均年齡（65±12）歲。兩組受試者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

3.2 HWE檢驗結(jié)果

共檢出MTHFR基因C677T位點3種基因型：CC（野生純合）型、CT（突變雜合）型、TT（突變純合）型，A1298C位點3種基因型：AA（野生純合）型、AC（突變雜合）型、CC（突變純合）型；共檢出MTRR基因A66G位點3種基因型：AA（野生純合）型、AG（突變雜合）型、GG（突變純合）型。

HWE檢驗結(jié)果顯示，對照組、病例組受試者MTHFR基因C677T、A1298C位點以及MTRR基因A66G位點各基因型頻率實測值與理論值的吻合度良好，其頻率均符合HWE（P>0.05），表明樣本來自于一個較大的且處于隨機婚配平衡狀態(tài)的群體，具有一定代表性，詳見表1。

3.3 兩組受試者基因型分布比較

兩組受試者中，MTHFR基因C677T位點CT型和A1298C位點AA型均占較大比例（占比分別超過40%和70%），MTRR基因A66G位點AA型占比均超過50%。兩組受試者各基因型分布頻率及等位基因頻率比較見表2～表4。

由表2～表4可見，兩組受試者MTHFR基因C677T、A1298C位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而兩組受試者MTRR基因A66G位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，對照組受試者MTHFR基因C677T位點CC型分布頻率及C等位基因頻率、A1298C位點CC型分布頻率及C等位基因頻率均顯著高于病例組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這提示MTHFR基因C677T位點和A1298C位點的多態(tài)性可能與冠心病的發(fā)生有關(guān)。

4 討論

MTHFR基因位于人類第1號染色體1p36.3處，編碼由656個氨基酸殘基組成的蛋白；該基因全長約20 kb，共有11個外顯子和10個內(nèi)含子。其中，C677T位點發(fā)生C→T突變可導(dǎo)致MTHFR酶中的丙氨酸被纈氨酸取代，A1298C位點發(fā)生A→C突變可導(dǎo)致該酶中的谷氨酸被丙氨酸取代[12]。MTRR基因位于人類第5號染色體5p15.2～5p15.3處，編碼由726個氨基酸殘基組成的蛋白；該基因全長約32 kb，共有15個外顯子和14個內(nèi)含子。其中，A66G位點發(fā)生A→G突變可導(dǎo)致MTRR酶中的甲硫氨酸被異亮氨酸取代[13]。MTHFR和MTRR基因位點的突變均能夠引發(fā)DNA的低甲基化進而阻礙甲基四氫葉酸的生成，造成血漿Hcy水平升高，使血管內(nèi)皮細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，由此促進血小板的聚集和血栓的形成，最終造成冠心病、腦卒中等多種心腦血管疾病的發(fā)生[14-15]。編碼基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）與冠心病遺傳易感性之間的相關(guān)性是近年來臨床研究的焦點之一。目前國外已有研究表明，載脂蛋白E（ApoE）[16-17]、MTHFR[6]等基因的突變對心腦血管疾病的發(fā)生均具有非常重要的作用，且MTHFR基因C677T、A1298C位點以及MTRR基因A66G位點是近年來的研究熱點。

本研究發(fā)現(xiàn)，陜西地區(qū)漢族人群MTHFR基因C677T位點發(fā)生突變比例較高（CT+TT型受試者的比例超過70%），高于國內(nèi)已報道的南寧市、華南地區(qū)和瓊海市人群（后三者CC型受試者占較大比例，分別為59%[18]、55%[19]、62%[20]）；A1298C位點突變率較低，AA型受試者占比超過70%，高出南部地區(qū)人群（后者AA型受試者占比約為57%[18，20]），充分體現(xiàn)了基因型分布的南北地區(qū)差異。MTRR基因A66G位點突變率與南部地區(qū)人群接近（后者約為50%[18，20]）。χ2檢驗結(jié)果顯示，對照組和病例組受試者MTHFR基因C677T、A1298C位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示陜西地區(qū)漢族人群MTHFR基因C677T位點和A1298C位點的多態(tài)性可能與該類人群冠心病的發(fā)生有關(guān)。而兩組受試者MTRR基因A66G位點各基因型分布頻率及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示該位點多態(tài)性可能與該類人群冠心病的發(fā)生無關(guān)。兩兩比較結(jié)果顯示，對照組受試者MTHFR基因C677T、A1298C位點CC型分布頻率及C等位基因頻率均顯著高于病例組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示C677T位點突變可能是冠心病發(fā)生的危險因素之一，而A1298C位點突變則可能是有益的。但由于冠心病與多種因素（如高血壓、糖尿病、吸煙等[21]）有關(guān)，故上述結(jié)論仍有待進一步確證。

綜上所述，陜西地區(qū)漢族人群MTHFR基因C677T位點的突變比例較高，而A1298C位點的突變比例較低，且上述兩個位點突變可能與該類人群冠心病的發(fā)生有關(guān)；MTRR基因A66G位點的突變率接近50%，但此位點突變可能與其冠心病的發(fā)生無關(guān)。但本研究樣本量較小，只能為相關(guān)基因突變與冠心病發(fā)生的相關(guān)性研究提供一定的參考；同時，我國不同地區(qū)、不同人群基因突變率的差異也會對研究結(jié)果造成影響。故在今后的研究中，本課題組將進一步擴大樣本量，收集不同地區(qū)、不同人群的基因突變類型，以進一步揭示易感基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生的相關(guān)性。

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（收稿日期：2018-03-07 修回日期：2018-08-23）

（編輯：張元媛）