黃獨素B致小鼠急性肝損傷的代謝組學研究

巫圣乾 張璐 龔夢鵑 王淑美 梁生旺 鄒忠杰

摘 要 目的：從代謝層面探索黃獨素B致小鼠急性肝損傷的潛在生物標志物，研究其肝毒性作用機制。方法：將24只小鼠隨機分成正常組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）和黃獨素B組（200 mg/kg），每組12只。一次性灌胃給予相應藥物24 h后，檢測小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平和肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用蘇木精-伊紅染色法觀察肝組織病理學變化；采用核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測尿液和肝組織中的代謝產(chǎn)物水平，并采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選黃獨素B肝毒性的潛在生物標志物。結(jié)果：與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著上升，肝組織中MDA水平顯著上升、SOD水平顯著下降（P<0.05）；肝組織細胞受損，出現(xiàn)明顯病理性改變；尿液和肝組織中代謝產(chǎn)物水平發(fā)生顯著改變，各篩選得到3種和6種與肝損傷相關(guān)的潛在生物標志物（P<0.05），分別為α-酮戊二酸、二甲胺、氧化三甲胺（尿液）和谷胱甘肽、?；撬?、肌苷、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸（肝組織）。結(jié)論：黃獨素B主要是通過自由基氧化作用損傷肝細胞，其對機體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、腸道菌群產(chǎn)生影響可能是其肝毒性的作用機制。

關(guān)鍵詞 黃獨素B；急性肝損傷；肝毒性；代謝組學；核磁共振氫譜；小鼠

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3046-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.05

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore potential biomarkers of acute hepatic injury induced by diosbulbin B and study its hepatotoxicity mechanism from metabolic aspect. METHODS： Totally 24 mice were randomly divided into normal group （0.5% sodium carboxymethylcellulose solution） and diosbulbin B group （200 mg/kg）， with 12 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically； 24 h later， the levels of ALT， AST in serum and MDA， SOD in liver tissue were determined. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver tissue. The levels of metabolism products in urine and liver tissue were determined by 1H-NMR. The potential biomarkers of diosbulbin B hepatotoxicity were screened by OPLS-DA. RESULTS： Compared with normal group， the levels of ALT and AST in serum， the level of MDA in liver tissue were increased significantly in diosbulbin B group， while the level of SOD in liver tissue was decreased （P<0.05）. The liver cells were damaged，with marked pathological changes. The levels of metabolic products were significantly changed in urine and liver tissue. Three and six potential biomarkers related to acute hepatic injury were obtained （P<0.05）， i.e. α-ketopglutaric acid， dimethylamine， trimethylamine oxide （urine） and glutathione， taurine， inosine， tyrosine， phenylalanine， histidine （liver tissue）. CONCLUSIONS： The hepatic injury induced by diosbulbin B are caused by free radical oxidation. The mechanism of hepatotoxicity may be the effect of diosbulbin B on tricarboxylic acid cycle， amino acid metabolism and intestinal flora.

KEYWORDS Diosbulbin B；Acute hepatic injury；Hepatotoxicity； Metabonomics； 1H-NMR； Mice

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨（Dioscorea bulbifera L.）的干燥塊莖，其藥性苦寒，歸脾、肝經(jīng)，具有消痰散結(jié)、清熱解毒之功效[1]。研究表明，黃藥子具有抗癌、抗菌、止痛、抗炎等藥理作用[2]，但同時具有肝毒性，可引起小鼠肝損傷[3]。黃獨素B（Diosbulbin B）屬于二萜內(nèi)酯類化合物，為黃藥子的主要毒性成分[4-5]，深入研究其肝毒性對黃藥子的開發(fā)和臨床應用具有重要意義。

代謝組學是20世紀 90 年代中期發(fā)展起來的一門新興學科，其是通過分析生物體因病理、生理刺激或基因改變所致的代謝產(chǎn)物的變化來研究生物體系代謝途徑的一種技術(shù)[6]。核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學技術(shù)是代謝組學研究中最常用的一種技術(shù)，具有不破壞樣本、分辨率高及重現(xiàn)性佳等的優(yōu)點[7]，適用于中藥等復雜成分的分析。已有研究采用代謝組學技術(shù)分析了黃藥子乙醇提取物致大鼠肝損傷的生物標志物[8]，并通過膽汁酸代謝網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)黃藥子和黃獨素B誘導肝損傷的作用機制可能與膽汁酸及脂肪酸代謝密切相關(guān)[9-10]。本研究利用1H-NMR技術(shù)對黃獨素B致小鼠急性肝損傷后尿液和肝組織的代謝產(chǎn)物變化進行研究，鑒定相關(guān)潛在的生物標志物，以明確黃獨素B肝損傷作用的代謝通路，為揭示其肝毒性的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

AVANCE Ⅲ 500 MHz型全數(shù)字化超導核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；ELX-808型酶標儀（美國BioTek公司）；1-14型低溫離心機（德國Sigma公司）；Vectra智能切片分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）。

1.2 藥品與試劑

黃獨素B單體化合物（廣東雋沐生物科技有限公司，批號：wkq16120204，純度：99.47%）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20171022、20171021、20171024、2017102）；疊氮化鈉（NaN3，天津市福晨化學試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海滬試實驗器材股份有限公司）；氘水（D2O）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、3-（三甲基甲硅烷基）氘代丙酸鈉（TSP-d4）（美國Sigma公司）；乙腈為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量20～24 g，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（粵）2016-0167。動物均在室溫（20±2）℃、相對濕度50%的屏障環(huán)境中適應性飼養(yǎng)3 d后再進行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 分組與給藥

取24只小鼠，按體質(zhì)量隨機分為正常組和黃獨素B組，每組12只。參照文獻[4]方法并結(jié)合預實驗結(jié)果，黃獨素B組小鼠一次性灌胃黃獨素B混懸液（200 mg/kg，給藥前以0.5% CMC-Na溶液制成10 mg/mL的混懸液）；正常組小鼠灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。

2.2 生物樣本的取樣

給藥24 h后，選取正常組和黃獨素B組小鼠各6只，于眼眶后靜脈叢取血并置于離心管，室溫下凝固后，在4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，取上層血清，進行血清實驗室指標檢測；然后頸椎脫臼處死小鼠，剖取肝臟，進行肝組織實驗室指標檢測和病理組織學檢查。兩組其余6只小鼠于給藥后分別放置于代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液（集尿器置于冰上，并加入1% NaN3溶液作為防腐劑），然后頸椎脫臼處死小鼠并剖取肝臟，進行尿液和肝組織代謝組學分析。

2.3 血清和肝組織實驗室指標檢測

取“2.2”項下小鼠血清，檢測ALT、AST水平；取“2.2”項下小鼠部分肝組織制成勻漿，在4 ℃條件下以3 500 r/min離心10 min，取上清，檢測MDA、SOD水平。試驗嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

2.4 肝組織病理學觀察

取“2.2”項下小鼠另外部分肝組織，以10%福爾馬林溶液固定12 h以上，依次進行乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋，切片（5 μm）并脫蠟后進行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。置于光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理學變化情況。

2.5 尿液和肝組織代謝組學分析

2.5.1 尿液樣本處理 取“2.2”項下小鼠尿液樣本400 μL，加入PBS 200 μL后靜置20 min，在4 ℃條件下以 3 500 r/min離心10 min。取上清液500 μL加至NMR樣品管中，再加入含0.05% TSP-d4的D2O 50 μL，振蕩混勻，轉(zhuǎn)移至核磁管中待測。

2.5.2 肝臟樣本處理 取“2.2”項下小鼠肝臟小葉樣本，稱質(zhì)量后按5 mL/g的量加入50%乙腈制成勻漿，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min。取上清液750 μL凍干后，加入PBS 450 μL和含0.05% TSP-d4的D2O 450 μL溶解，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至核磁管中待測。

2.5.3 1H-NMR數(shù)據(jù)采集及分析 設置實驗溫度為298 K，采用預飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰，采樣時間為3.28 s，弛豫延遲時間為3.0 s；設置樣本譜寬為10 kHz，采樣點數(shù)為64 K，采集次數(shù)為128次；采用線寬為0.3 Hz的指數(shù)窗函數(shù)進行傅里葉變換。采用MestReNova 6.1軟件對所獲1H-NMR圖譜進行手動相位和基線校正后，參照TSP-d4（δ0）對圖譜的化學位移進行定標。在δ0.5～9.5區(qū)域按δ0.01等間隔分段積分，對于尿液和肝組織樣本，分別將區(qū)域δ4.47～6.01和δ4.68～5.20設為0積分段，然后采用Excel 2010軟件對圖譜各分段積分值進行歸一化處理。將所得數(shù)據(jù)乘以10 000后導入SIMCA-P 12.0軟件，經(jīng)Pareto標度化預處理后，進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。

2.5.4 模型可靠性驗證及代謝物鑒定 采用7倍交叉驗證法對OPLS-DA 模型的可靠性進行驗證[11]，得到OPLS- DA模型的主要參數(shù)。尿液：R2X（cum）=0.70，R2Y（cum）=0.90，Q2（cum）=0.81；肝組織：R2X（cum）=0.87，R2Y（cum）=0.83，Q2（cum）=0.89。從上述參數(shù)可以看出本模型具有較高的可靠性。然后，根據(jù)化學位移值、峰的裂分、耦合常數(shù)及相關(guān)文獻報道[12-13]對代謝物譜峰進行鑒定。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清和肝組織實驗室指標檢測結(jié)果

與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明黃獨素B可造成小鼠肝組織損傷。兩組小鼠血清中ALT、AST和肝組織中MDA、SOD水平檢測結(jié)果見表1。

3.2 小鼠肝組織病理學觀察結(jié)果

正常組小鼠肝組織細胞邊界清晰、排列整齊、形態(tài)正常，未見組織病理學異常；黃獨素B組小鼠肝組織細胞出現(xiàn)少量脂肪樣變性，部分細胞出現(xiàn)水腫，表明黃獨素B對小鼠肝組織細胞造成了損傷，引起了明顯的肝組織病理性改變。兩組小鼠肝組織病理學顯微圖見圖 1。

3.3 小鼠尿液和肝組織代謝組學分析結(jié)果

小鼠尿液和肝組織的1H-NMR圖譜見圖2、圖3；正常組與黃獨素B組小鼠代謝物差異的OPLS-DA分析結(jié)果見圖4。由圖4可見，黃獨素B組與正常組樣本點在PC1維上可以完全分開，表明黃獨素B引起小鼠肝損傷后使機體的代謝表型發(fā)生了明顯變化。

選取OPLS-DA 模型中變量重要性投影參數(shù)VIP>1的差異變量，再用t檢驗對篩選到的差異變量在黃獨素B組與正常組之間進行驗證，以變量差異的P<0.05判定其為潛在的生物標志物[14]。按照上述原則，最終在尿液和肝組織中分別篩選得到α-酮戊二酸等3種和谷胱甘肽等6種代謝物的峰面積差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），判定其為黃獨素B肝毒性相關(guān)的潛在生物標志物，詳見表2。

4 討論

4.1 黃獨素B造成肝損傷的作用機制

ALT、AST在正常狀態(tài)時即存在于肝細胞中，兩者水平明顯上升則表明肝細胞受到了損傷[15]；MDA為機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應的重要產(chǎn)物，其水平的高低可間接反映機體細胞受自由基攻擊后的損傷程度；SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，其可對抗與阻斷自由基對細胞造成的損害并及時修復受損細胞[16]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，表明黃獨素B可通過自由基氧化作用而損傷肝細胞。

肝細胞脂肪樣變性的主要原因為脂質(zhì)蛋白合成障礙、中性脂肪合成過多、細胞發(fā)生水腫[17-18]。本研究結(jié)果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織細胞發(fā)生了脂肪樣變性及水腫。其原因可能是黃獨素B引起小鼠肝細胞脂質(zhì)代謝異常，并通過自由基氧化作用損傷細胞膜，造成細胞膜通透性增加，從而使其發(fā)生水腫。

4.2 黃獨素B引發(fā)肝損傷后機體的多參數(shù)代謝應答

谷胱甘肽能激活各種酶，在三羧酸循環(huán)中起到重要作用，能促進脂肪、蛋白質(zhì)、糖代謝，使機體獲得高能量，進而影響細胞的代謝過程[19]，改善中毒性肝炎、感染性肝炎的癥狀。肌苷為腺嘌呤的前體，能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，而輔酶A與人體能量代謝、物質(zhì)合成、免疫系統(tǒng)的激活都密切相關(guān)，其可使組織細胞在低能量、缺氧狀態(tài)下繼續(xù)順利進行代謝[20]。本研究結(jié)果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織中谷胱甘肽和肌苷水平均顯著下降，說明其體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)等的代謝受到影響，能量代謝減少，提示小鼠發(fā)生肝損傷使得肝組織能量代謝水平下降。

?；撬峋哂袧B透調(diào)節(jié)、抗氧化、穩(wěn)定細胞膜等生理作用[21]，可通過減弱氧化應激和抑制脂質(zhì)過氧化來緩解長期飲酒造成的肝損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織中?；撬崴斤@著降低，表明黃獨素B可能通過氧化應激與脂質(zhì)過氧化兩方面造成肝損傷。另外，?；撬峥膳c游離膽汁酸結(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸，飲食中的脂肪酸又能改變膽汁酸成分[8]，而膽汁酸又可對腸道菌群產(chǎn)生影響。因此，?；撬岷湍懼峋c腸道菌群有較密切關(guān)系，其水平變化提示黃獨素B的肝毒性可能與腸道菌群改變有關(guān)。

α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，連接著細胞內(nèi)的碳-氮代謝，參與體內(nèi)多種物質(zhì)的合成代謝[23]；酪氨酸、苯丙氨酸代謝通路主要在肝組織中進行，其水平的變化與肝功能密切相關(guān)[24]；氧化三甲胺與二甲胺為腸道菌群代謝活動的產(chǎn)物，膽堿在腸道內(nèi)經(jīng)由腸道微生物作用生成三甲胺，進而被代謝成氧化三甲胺與二甲胺[25]。本研究結(jié)果顯示，黃獨素B組小鼠體內(nèi)酪氨酸、苯丙氨酸、α-酮戊二酸水平均異常升高，提示肝細胞內(nèi)線粒體活性下降，相關(guān)代謝物堆積，最終導致能量合成減少、細胞受損；同時，氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸）水平顯著上升，提示氧化應激可能造成了肝組織氨基酸代謝紊亂及蛋白質(zhì)變性降解[26]；而氧化三甲胺與二甲胺水平的異常變化則說明黃獨素B可能引起小鼠腸道菌群生態(tài)的破壞，導致腸道菌群功能失常。本研究結(jié)果顯示，黃獨素B能分別使小鼠尿液中3種和肝組織中6種與急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標志物水平發(fā)生顯著改變，表明其造成小鼠肝損傷可能與機體能量和物質(zhì)代謝、氨基酸代謝及氧化應激有關(guān)。

綜上所述，黃獨素B主要是通過自由基氧化作用損傷肝細胞，其肝毒性的可能機制為其對機體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、腸道菌群等產(chǎn)生影響。

參考文獻

[ 1 ] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1999：226.

[ 2 ] 張驥鵬，高旺，高慧媛. 中藥黃獨的研究進展[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2008，10（2）：34-37.

[ 3 ] 宋聿明，蘇鈺文，江振洲，等. 黃藥子肝臟毒性研究進展[J].中國臨床藥理學與治療學，2016，21（2）：237-240.

[ 4 ] 牛成偉，陸賓，季莉莉，等. 黃獨素B誘導小鼠急性肝損傷及其機制[J]. 中國中藥雜志，2014，39（7）：1290-1292.

[ 5 ] 曲曉宇，周利婷，張四喜，等. 黃獨素B致小鼠肝損傷過程中對肝外排型轉(zhuǎn)運體Mrp2表達的影響[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2016，36（19）：1633-1636.

[ 6 ] NICHOLSON JK，LINDON JC，HOLMES E. “Metabonomics”：understanding the metabolic responses of living system to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[ 7 ] 楊中良，楊秀云，李劍，等. 代謝組學分析技術(shù)在中藥毒理研究中的應用[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2014，16（8）：681- 684.

[ 8 ] 盛云華，喬靖怡，金若敏，等. 基于1H-核磁共振代謝組學研究黃藥子乙醇提取物致肝損傷的潛在生物標志物[J].中國藥理學與毒理學雜志，2016，30（4）：306-316.

[ 9 ] 徐英，陳崇崇，楊莉，等. 基于膽汁酸代謝網(wǎng)絡分析中藥黃藥子的肝毒性[J]. 藥學學報，2011，46（1）：39-44.

[10] 熊印華，徐英，楊莉，等. 黃藥子誘導肝損傷大鼠血清脂肪酸的代謝輪廓[J]. 藥學學報，2017，52（5）：753-759.

[11] 鄒忠杰，施旭光，龔夢鵑. 利血平所致大鼠脾虛證代謝組學研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2012，23（3）：291-294.

[12] DING L，HAO F，SHI Z，et al. Systems biological responses to chronic perfluorododecanoic acid exposure by integrated metabonomic and transcriptomic studies[J]. J Proteome Res，2009，8（6）：2882-2891.

[13] WEI L，LIAO P，WU H，et al. Metabolic profiling studies on the toxicological effects of realgar in rats by 1H-NMR spectroscopy[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2008，234（3）：314-325.

[14] 龔夢鵑，岳賀，王淑美，等. 基于血清和肝代謝組學研究護肝片的保肝作用[J]. 中國藥房，2017，28（34）：4776-4780.

[15] 張曉鳴，杜國有. ALT、AST、ALP、γ-GT、LDH聯(lián)合檢測在肝病診斷中的意義[J]. 右江民族醫(yī)學院學報，1996（2）：50-52.

[16] 斯琴，布日額. 苦瓜提取物影響Ⅱ型糖尿病小鼠血清SOD、MDA的Meta分析[J]. 中醫(yī)藥信息，2015，32（1）：17-20.

[17] 丁曉東，范建高. 非酒精性肝脂肪變性和脂肪性肝炎的發(fā)生機制[J]. 現(xiàn)代消化及介入診療，2009，14（4）：237-242.

[18] 李妍，劉玉蓮，紀朋艷，等. 五味子水提物對微波輻射引起大鼠肝細胞氧化應激損傷的預防作用[J]. 吉林大學學報（醫(yī)學版），2013，39（6）：1173-1176.

[19] 賈浩，孫吉康，王平，等. 單面針根和葉的代謝組比較研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2018，38（10）：60-65.

[20] 錢程江. 六大類常見護肝藥的功效[J]. 肝博士，2010（4）：52.

[21] IB?NEZ-SAMANIEGO L，SALCEDO M，VAQUERO J，et al. De novo autoimmune hepatitis after liver transplantation：a focus on glutathione S-transferase theta 1[J]. Liver Transpl，2017，23（1）：75-85.

[22] 王永成，陳濤，石婷，等. 嘌呤核苷及其衍生物的代謝工程[J]. 中國生物工程雜志，2015，35（5）：87-95.

[23] 付瑩，王紅權(quán)，趙玉蓉. α-酮戊二酸及其生理作用[J]. 湖南飼料，2017（5）：31-33.

[24] 仇守蓓. 基于代謝組學的中藥菊三七致肝毒性機理研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學，2018.

[25] 姜東京，張麗，曹雨誕，等. 腸道菌群在中藥研究中的應用[J]. 中國中藥雜志，2016，41（17）：3218-3225.

[26] 周寧. 酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的基因組學和蛋白質(zhì)組學研究[D]. 杭州：浙江大學，2013.

（收稿日期：2018-05-06 修回日期：2018-09-30）

（編輯：段思怡）