白及藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析

劉剛 丁志山 劉育辰 張永萍 萬超 羅成凱

摘 要 目的：建立白及藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對樣品進行聚類。方法：采用HPLC法，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。以1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯為參照，繪制10批藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）進行相似度評價，確定共有峰，并采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對其進行聚類分析。結果：10批藥材樣品的HPLC圖譜有15個共有峰，其中9批相似度均大于0.90；經(jīng)驗證，10批藥材樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。10批藥材樣品可聚為3類，S1、S2、S3、S4、S6、S8、S9、S10聚為第1類，S7聚為第2類，S5為第3類。結論：所建HPLC指紋圖譜和聚類分析結果可為白及藥材的質量控制提供參考。

關鍵詞 白及；高效液相色譜法；1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯；指紋圖譜；聚類分析

中圖分類號 R927.2；R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3050-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.06

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Bletilla striata， and conduct cluster analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 270 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Using 1， 4-two [4-（glucose oxy） benzyl]-2-isobutyl malate as reference， HPLC chromatograms of 10 batches of medicinal samples were determined. Similarity evaluation was conducted by using Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004 A edition）. Common peaks were determined， and cluster analysis was also conducted for it by using SPSS 23.0 statistic software. RESULTS： There were 15 common peaks in 10 batches of samples， and the similarities of 9 batches were more than 0.90. After validation， HPLC chromatograms of 10 batches of medicinal material were all in agreement with control fingerprint. The 10 batches of samples could be clustered into 3 categories. S1， S2， S3， S4， S6， S8， S9， S10 were clustered into category 1； S7 was clustered into category 2； S5 was clustered into category 3. CONCLUSIONS： Established fingerprint and the cluster analysis results can provide reference for the quality control of B. striata.

KEYWORDS Bletilla striata； HPLC； 1， 4-two [4-（glucose oxy） benzyl]-2-isobutyl malate； Fingerprint； Cluster analysis

白及為蘭科植物白及[Bletilla striata （Thunb.） Reiehb. f.]的干燥塊莖，其味苦、甘、澀，微寒；歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌之功效，臨床多用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥的治療[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白及具有止血[2]、抗菌[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]等多種藥理作用。白及中含有多糖類、菲類、聯(lián)菲類、聯(lián)菲醚類、聯(lián)芐類、甾體類和三萜類等化學成分[6]，其中2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基酯類的含量較高[7]。

2015年版《中國藥典》（一部）關于白及藥材的質量控制標準中僅有理化鑒別、薄層色譜鑒別及水分、灰分檢查等項目[1]。目前，對白及的研究主要集中在化學成分[6]、藥理作用[2-5]、含量測定[7-8]等方面。但據(jù)筆者調研所知，目前白及的野生資源十分匱乏，藥材主要源自栽培，而白及藥材質量受生態(tài)環(huán)境的影響很大，并且市場上存在大量偽品（如黃花白及、小白及、華白及、竹葉蘭、獨蒜蘭和舌苞蘭等），使白及藥材的有效性及安全性無法得到保障[9]。僅靠一兩個化學成分的含量測定，并不能有效控制白及藥材整體質量，而且該藥材中許多成分的對照品在國家藥品標準物質目錄中均查詢不到，這給同時檢測其中多指標成分的含量帶來了一定難度。指紋圖譜是醫(yī)藥學界公認的控制中藥材質量的有效方法，具有整體性和模糊性的特點。為此，筆者收集不同產(chǎn)地來源的白及藥材，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對得到的數(shù)據(jù)進行處理，結合聚類分析方法進行質量評價，為其質量控制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate-3000型HPLC儀，包括紫外檢測器等[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；AR2140型萬分之一電子分析天平、EX225DZH型十萬分之一電子分析天平[美國奧豪斯儀器（上海）有限公司]； Q300-B型高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）；HT-220A型色譜柱柱溫箱（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；DRHH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海雙捷實驗設備有限公司）；SB-5200DT型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；8HZ-0111型循環(huán)水多用真空泵（上海予英儀器有限公司）。

1.2 試劑

1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品（成都洛瑪生物科技有限公司，批號：CHB160626，純度：98%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

試驗用白及藥材均由筆者購買/采集（來源見表1），經(jīng)貴陽中醫(yī)學院王世清教授鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%B→20%B；5～25 min，20%B→35%B；25～45 min，35%B→60%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品6.80 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加0.1%磷酸溶液-乙腈（3 ∶ 2，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品適量，粉碎過3號篩，取約1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞瓶中，加甲醇20 mL，稱定質量，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）提取30 min，取出，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S5）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以 1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間的RSD均小于2%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S5）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、15、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S5）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，15個共有峰相對保留時間的RSD均小于1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰相關分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對10批藥材樣品的HPLC圖譜進行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版），以樣品S1的HPLC圖譜為對照，進行整體相似度評價。結果顯示，10批藥材樣品有9批相似度均大于0.90，表明藥材樣品間差異較小，質量穩(wěn)定性良好，詳見表2。

2.4.3 共有峰的指認及相關分析 10批藥材樣品有15個共有峰，通過與對照品的HPLC圖譜比對，指認4號峰為1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯峰；該峰分離良好，峰面積較大，且為所有藥材樣品共有，故設定為參照峰，計算其他峰相對于該峰的相對保留時間和相對峰面積及其RSD，詳見表3、表4。

2.5 聚類分析

以各共有峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，應用組間平均數(shù)聯(lián)結法結合平方歐氏距離對藥材樣品進行聚類分析，結果見圖3。結果顯示，10批藥材可聚為3類：第1類為S1、S2、S3、S4、S6、S8、S9、S10，大部分藥材樣品的相似度大于0.95；第2類為S7，該批藥材樣品的相似度接近0.95；第3類為S5，該批藥材樣品的相似度相對較低，接近0.90。

3 討論

預試驗中，筆者以色譜峰峰面積及峰數(shù)為指標，考察了不同提取時間、不同提取溶劑、加熱回流提取和超聲提取對結果的影響。最終確定白及藥材的提取方法為20倍體積的甲醇超聲提取30 min。筆者還考察了甲醇-水、0.1%磷酸溶液-甲醇、乙腈-水和0.1%磷酸溶液-乙腈4種體系作為流動相時對結果的影響。最終發(fā)現(xiàn)，采用0.1%磷酸溶液-乙腈為流動相時其色譜峰峰形對稱性好，基線平整，能夠獲得較好的分離效果。

本試驗通過對10批白及藥材樣品的指紋圖譜分析可知，其共有峰的相對保留時間差異較小，但相對峰面積差異較大。但采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A版）對各批藥材樣品進行整體相似度評價的結果顯示，10批白及藥材樣品中有9批相似度均大于0.90，說明不同來源白及藥材樣品在化學組成方面具有很好的相似性。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜和聚類分析結果可為白及藥材的質量控制提供參考。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：103.

[ 2 ] 董永喜，劉星星，董莉，等. 白及多糖對血熱出血模型大鼠的止血作用及機制研究[J]. 中國藥房，2016，27（31）：4347-4350.

[ 3 ] 俞杭蘇，代斌玲，錢朝東，等. 白及須根化學成分及其體外抗菌活性研究[J]. 中藥材，2016，39（3）：544-547.

[ 4 ] 仰蓮. 白及茋類化學成分及其抗人肺癌細胞A549活性研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學，2016.

[ 5 ] 張兵，史亞，周芳美，等. 白及提取物體外抗流感病毒藥效及其機制研究[J]. 中藥材，2017，40（12）：2933-2938.

[ 6 ] 仰蓮，彭成，李小紅，等. 白及的化學成分及生物活性研究進展[J]. 中藥與臨床，2014，5（6）：59-64.

[ 7 ] 梅朝葉，向文英，楊武，等. UPLC-MS/MS 同時測定白及中6 個指標成分的含量[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（8）：1233-1237.

[ 8 ] 張曉靜，趙艷霞，鄧雁如，等. HPLC 同時測定白及中 3 種成分的含量[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（21）：40-42.

[ 9 ] 陳美君，李峰慶，呂蒙，等. 白及與其混偽品ITS2序列二級結構比較與鑒別[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（15）：46-52.

（收稿日期：2018-04-21 修回日期：2018-06-18）

（編輯：張 靜）