基于三黃瀉心湯的黃芩—大黃—黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響

鄧麗紅　謝臻　陳勇　李耀華　龐婷

中圖分類號 R284；R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0334-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.11

摘 要 目的：基于三黃瀉心湯（簡稱“瀉心湯”）考察黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響，為研究中藥復(fù)方藥味劑量組成配伍的化學(xué)機(jī)制提供參考。方法：以高效液相色譜法測定黃芩苷、漢黃芩苷含量。固定黃芩劑量（3 g）不變，以大黃和黃連的不同劑量為因素，黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率為響應(yīng)值，設(shè)計二因素五水平星點(diǎn)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩-大黃-黃連最佳劑量配伍，并與經(jīng)典劑量瀉心湯（黃芩3 g、大黃6 g、黃連3 g）比較其中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率的變化。結(jié)果：黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時提取液中黃芩苷和漢黃芩苷的總?cè)艹雎首罡?，?yàn)證試驗(yàn)中黃芩苷和漢黃芩苷的總?cè)艹雎势骄鶠?1.89%（RSD=0.46%，n=3），與預(yù)測值22.54%的相對誤差為2.88%；與經(jīng)典劑量瀉心湯比較，最優(yōu)配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷總?cè)艹雎侍岣吡?7.21%。結(jié)論：基于瀉心湯的黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍對黃芩苷和漢黃芩苷溶出有一定影響，當(dāng)黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時其溶出率高于經(jīng)典劑量。

關(guān)鍵詞 三黃瀉心湯；黃芩苷；漢黃芩苷；劑量配伍；星點(diǎn)設(shè)計；響應(yīng)面法；溶出率

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of different dose compatibility of Scutellaria baicalensis-Rheum palmatum- Coptis chinensis based on Sanhuang Xiexin decoction （shorted for Xiexin decoction） on dissolution rate of baicalin and baicalein， and to provide reference for studying chemical mechanism of TCM compound dose composition compatibility. METHODS： HPLC method was used to determine the contents of baicalin and baicalein. By fixing the dose of S. baicalensis （3 g）， using the dose of R. palmatum and C. chinensis as factors， dissolution rate of baicalin and baicalein as response value， two-factor and five-level central composite test was designed. The optimal dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis was optimized by response surface method， and compared with the dissolution rate of baicalin and baicalein in classic dose Xiexin decoction （S. baicalensis 3 g， R. Palmatum 6 g， C. chinensis 3 g）. RESULTS： When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis were 3， 1.76， 0.17 g， total dissolution rate of baicalin and baicalein was the highest in extract. The average total dissolution rate of baicalin and baicalein in validation test was 21.89% （RSD=0.46%， n=3）， and the relative error was 2.88% with the predicted value of 22.54%. Compared with the classical dose of Xiexin decoction， the total dissolution rate of baicalin and baicalein in the optimum dose of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis in extract was increased by 47.21%. CONCLUSIONS： The different dose compatibility of S. baicalensis-R. Palmatum-C. chinensis based on Xiexin decoction influence the dissolution of baicalin and baicalein to certain extent. When the doses of S. baicalensis， R. palmatum， C. chinensis are 3， 1.76， 0.17 g， dissolution rate of baicalin and baicalein are higher than that of classic dose.

KEYWORDS Sanhuang Xiexin decoction； Baicalin； Baicalein； Dose compatibility； Central composite design； Response surface methodology； Dissolution rate

三黃瀉心湯（后文簡稱“瀉心湯”）出自《金匱要略》，其藥物組成為大黃二兩（6 g）、黃連一兩（3 g）、黃芩一兩（3 g），水煎后服用，具有清心瀉火、涼血止血的功效，主治心火內(nèi)盛、迫血妄行及癥見吐血衄血、便秘溲赤者[1]?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用顯示，瀉心湯適應(yīng)證較廣泛，且臨床療效較好[2-4]。蒽醌類、黃酮類和生物堿類成分是瀉心湯中的主要活性成分[5]，同時也是多種中草藥的有效成分。文獻(xiàn)報道，黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)心血管等藥理作用[6-10]，而黃芩中含有黃芩苷、漢黃芩苷等黃酮成分[11]。瀉心湯的經(jīng)典劑量比例為大黃-黃芩-黃連（2 ∶ 1 ∶ 1）。目前，對本方的藥理作用研究較多，但是對瀉心湯中黃芩-大黃-黃連不同劑量配伍是否會引起其中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出變化還未可知。許多學(xué)者利用數(shù)學(xué)方法進(jìn)行化學(xué)成分變化規(guī)律的研究，如均勻設(shè)計法、正交設(shè)計法、偏最小二乘法等[12]，與均勻設(shè)計法、正交設(shè)計法比較，星點(diǎn)設(shè)計法具有試驗(yàn)次數(shù)較少、精度較高等優(yōu)點(diǎn)[13]。故本研究以黃芩苷和漢黃芩苷溶出率為響應(yīng)值，采用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩-大黃-黃連的最佳劑量配伍，為研究中藥復(fù)方藥味劑量組成配伍的化學(xué)機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜儀，包括2998PDA檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、Empower3工作站（美國沃特世科技有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；FW17型中草藥打粉機(jī)（天津泰斯特儀器設(shè)備有限公司）；HWS24型電熱恒溫數(shù)顯水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

中藥飲片大黃、黃連、黃芩（廣州康美藥業(yè)股份有限公司，批號：161008891、161106631、161105141）；黃芩苷對照品、漢黃芩苷對照品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：160624、160711，純度：均≥98%）；甲醇、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（流動相A）-0.2%磷酸水溶液（流動相B），梯度洗脫（0～10 min，45%A；10～55 min，45% A～70%A；55～56 min，70%A～45%A）；流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液的制備。精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷對照品適量 ，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作為貯備液。分別精密移取一定量的上述貯備液至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，分別制成每1 mL溶液中含黃芩苷 0. 050 22 mg、漢黃芩苷0.008 08 mg的混合對照品溶液，然后以離心半徑為16 cm、13 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。

（2）不同劑量配伍黃芩-大黃-黃連提取液的制備。精密稱定黃芩藥材粉末3 g，按表2星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)，精密稱定相應(yīng)量大黃、黃連粉末，置于圓底燒瓶中，加入30倍量水，稱質(zhì)量；浸泡30 min，加熱回流提取20 min，放冷；補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，得瀉心湯提取液。

（3）供試品溶液的制備。精密移取“2.1.2（2）”項(xiàng)下提取液（按方案9制備）1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，以離心半徑為16 cm、13 000 r/min離心10 min ，取上清液，得供試品溶液。

（4）缺黃芩陰性樣品溶液的制備。按“2.1.2（2）”項(xiàng)下劑量精密稱定大黃、黃連粉末并進(jìn)行相應(yīng)處理后，得到缺黃芩的提取液，精密移取缺黃芩的提取液1 mL，按“2.1.2（3）”項(xiàng)下方法操作得缺黃芩陰性樣品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察 （1）專屬性試驗(yàn)。分別取混合對照品溶液、供試品溶液和缺黃芩陰性樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，其他組分不干擾黃芩苷和漢黃芩苷的測定，分離度均大于1.5，方法專屬性和選擇性好，色譜圖見圖1。

（2）線性關(guān)系考察。分別取“2.1.2（1）”項(xiàng)下混合對照品溶液2、4、6、8、10、12、14 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以混合對照品進(jìn)樣量 （x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得黃芩苷回歸方程為y=3×106x-123 389（r=0.999 9），檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.100 44～0.703 08 μg；漢黃芩苷回歸方程為y=4×106x-325 13（r=0.999 9），檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.016 16～0.113 12 μg。

（3）精密度試驗(yàn)。取“2.1.2（3）”項(xiàng)下同一供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.1.2（3）”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，24 h內(nèi)，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（5）重復(fù)性試驗(yàn)。精密移取“2.1.2（2）”項(xiàng)下同一瀉心湯提取液1 mL，共6份，按“2.1.2（3）”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，然后按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD值均小于2.0%（n=6）。

（6）準(zhǔn)確度試驗(yàn)。精密移取“2.1.2（2）”項(xiàng)下同一瀉心湯提取液0.5 mL ，共6份，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.1.2（3）”項(xiàng)下方法制備溶液，然后按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，黃芩苷、漢黃芩苷平均加樣回收率分別為99.66%、99.57%，RSD值均小于2.0%（n=6）。

2.2 星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩-大黃-黃連劑量配伍

2.2.1 星點(diǎn)設(shè)計 因?yàn)a心湯中黃芩苷和漢黃芩苷來自黃芩，故固定黃芩的劑量不變（均為3 g），以大黃（X1）、黃連（X2）的量為考察因素，以黃芩苷、漢黃芩苷溶出率之和（Y）為指標(biāo)（響應(yīng)值），采用星點(diǎn)試驗(yàn)法設(shè)計黃芩-大黃-黃連的配伍劑量[14]。因素與水平見表1，星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 模型擬合 以大黃（X1）、黃連（X2）的量為自變量，以Y值為因變量，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，以方程的P<0.05作為顯著標(biāo)準(zhǔn)，選擇有較大r值的模型，得多元線性方程為Y=19.945 19+0.5579 2X1- 2.893 49X2（r=0.982 7，P<0.05）；擬合的二項(xiàng)式方程為Y=23.137 20-3.672 07X2-0.013 09X12-0.106 55X22+0.236 43X1X2（r=0.997 0，P<0.05），復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.997 0，相對多元線性擬合有提高，表明該方程有較大的可信度，預(yù)測性較好。簡化的二項(xiàng)式擬合結(jié)果見表3。

由表3可知，一次項(xiàng)X2、二次項(xiàng)X22、交互項(xiàng)X1X2對黃芩苷和漢黃芩苷溶出率均有顯著影響（P<0.05），特別是X2項(xiàng)影響最為顯著，提示黃連的量的微小變化即對黃芩苷和漢黃芩苷的溶出有較大影響。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩-大黃-黃連劑量配伍 大黃與黃連的量對黃芪類成分溶出有交互作用。固定黃芩和大黃的量不變時，增大黃連的量，Y值降低；固定黃芩和黃連的量不變，增大大黃的量，Y值有較小幅度的增大，見圖2。

應(yīng)用LINGO 9.0軟件求導(dǎo)后可得：當(dāng)黃芩的量為3 g、大黃的量為1.76 g、黃連的量為0.17 g 時，有最大Y值22.54%。故本試驗(yàn)最終選取黃芩-大黃-黃連的最優(yōu)劑量配伍為黃芩3 g、大黃1.76 g、黃連0.17 g。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)劑量比例提取黃芩-大黃-黃連溶液3份，按照前述方法測定其中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率。結(jié)果所制3份黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷平均總?cè)艹雎蕿?1.89%，與預(yù)測值22.54%的相對誤差為2.88%（n=3），可見預(yù)測性較好。

2.3 最優(yōu)配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液與經(jīng)典劑量瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率比較

分別按黃芩-大黃-黃連最佳劑量配伍（黃芩3 g、大黃1.76 g、黃連0.17 g）和經(jīng)典劑量比例（大黃6 g、黃連3 g、黃芩3 g）瀉心湯制備提取液，按前述方法處理并測定其中黃芩苷與漢黃芩苷的總?cè)艹雎剩▋煞N劑量的總?cè)艹雎史謩e用Y1、Y2表示），并計算最優(yōu)配伍劑量黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率的增加率（%）[（│Y2-Y1│）/Y2×100%]，結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)配伍劑量黃芩-大黃-黃連與經(jīng)典劑量瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率比較結(jié)果（%）

Tab 4 Comparison of dissolution rate of baicalin and baicalein in optimal dose of S. baicalensis- R. palmatum-C. chinensis and classic dose of Xiexin decoction（%）

[試驗(yàn)號 Y1 Y2 增加率 1 21.98 14.84 48.11 2 21.91 14.79 48.14 3 21.78 14.97 45.80 平均值 21.89 14.87 47.21 ]

3 討論

固定黃芩的劑量不變，只改變其他2味中藥的劑量，是考慮到瀉心湯中的黃芩苷和漢黃芩苷來自黃芩，固定黃芩在整方中的量不變，更便于比較大黃、黃連量的變化對瀉心湯中黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響。本研究應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化不同劑量配伍黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷溶出變化，本次建立的二項(xiàng)式擬合模型是科學(xué)、合理、有效的，建立的方程能夠較好地預(yù)測黃芩苷、漢黃芩苷的總?cè)艹雎?，具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，大黃劑量的變化對黃芩苷和漢黃芩苷溶出的影響相對于黃連小，可能是酸性成分之間（即大黃中酸性成分與黃芩中黃酮酸性成分）相互作用弱于酸性、堿性成分之間（即黃芩中黃酮酸性成分和黃連中堿性成分）的相互作用的緣故[15]。

在星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)中，由于大黃與黃連劑量在變化，大黃、黃連有效成分的溶出也將會受到影響。若要同時考察大黃、黃連有效成分的溶出變化，則需要考慮的影響因素太多，限于篇幅有限，故本研究未展開研究。瀉心湯中黃芩瀉肺燥濕解毒，黃連瀉心清胃、燥濕解毒，大黃瀉火通肺瀉毒、引火下行?？梢?，黃芩、黃連與大黃都對瀉心湯的瀉火解毒這一功效有重要影響。因此，本研究將在后續(xù)研究中分別考察三者不同劑量配伍對大黃、黃連有效成分溶出變化的影響。

黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩苷和漢黃芩苷的溶出率與配伍比例呈現(xiàn)非線性變化。當(dāng)黃芩-大黃-黃連提取液中黃芩、大黃、黃連的劑量分別為3、1.76、0.17 g時，黃芩苷、漢黃芩苷總?cè)艹雎瘦^經(jīng)典比例瀉心湯增加了47.21%，這可能會提高黃芩-大黃-黃連提取液的臨床療效。但是黃芩-大黃-黃連提取液的藥效不僅與其中黃芩苷和漢黃芩苷溶出率有關(guān)，還需要對其他的有效成分進(jìn)行測定及藥理試驗(yàn)驗(yàn)證，才能更深入地探究不同劑量配伍對黃芩-大黃-黃連提取液中有效成分的影響，這有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 范永升.金匱要略[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：291-292.

[ 2 ] 苗婷婷.三黃瀉心湯研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2016，32（3）：190-192.

[ 3 ] 李顏，郭澄.三黃瀉心湯的現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展[J].中國藥房，2010，21（11）：1048-1051.

[ 4 ] 梁晉川，袁麗，譚正懷.瀉心湯臨床研究進(jìn)展[J].中國藥房，2011，22（31）：2965-2968.

[ 5 ] 耿慧春，辛穎，艾鳳偉，等.三黃瀉心湯HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2008，39（4）：524-529.

[ 6 ] 羊波，應(yīng)茵，陳苓麗，等.黃酮類化合物抗炎作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥師，2016，19（7）：1369-1373.

[ 7 ] 曾祥偉，楊麗燕，陳金龍，等.黃酮類成分抗自由基氧化活性進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（9）：2694-2697.

[ 8 ] 楊楠，賈曉斌，張振海，等.黃酮類化合物抗腫瘤活性及機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40（3）：373-381.

[ 9 ] 游庭活，劉凡，溫露，等.黃酮類化合物抑菌作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2013，38（21）：3645-3650.

[10] 黃河勝，馬傳庚，陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2000，25（10）：13-16.

[11] 楊立新，劉岱，馮學(xué)鋒，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地黃芩中黃酮化合物的含量[J].中國中藥雜志，2002，27（3）：9-13.

[12] 麥藍(lán)尹，李怡萱，陳勇，等.基于數(shù)理統(tǒng)計方法學(xué)的中藥復(fù)方配伍研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2014，39（10）：1749-1756.

[13] 劉艷杰，項(xiàng)榮武.星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2007，24（6）：455-457.

[14] 謝臻.大承氣湯方藥物質(zhì)基礎(chǔ)及其配伍規(guī)律研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[15] 馮有龍，胡浩彬，余伯陽.瀉心湯不同配伍情況下黃酮類、蒽醌類和生物堿類成分的含量比較[J].中國天然藥物，2007，5（4）：281-284.

（收稿日期：2017-08-21 修回日期：2017-10-08）

（編輯：林 靜）