大孔吸附樹脂分離純化赤雹根總皂苷的工藝研究

聶佳　李忠思　佟繼銘　劉春楠　劉克明　劉永平

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0322-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.08

摘 要 目的：考察大孔吸附樹脂分離純化赤雹根總皂苷（TSTR）的工藝。方法：采用紫外-可見分光光度法測定TSTR含量。通過比較不同型號（AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9）大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附、解吸性能，篩選大孔吸附樹脂型號；以TSTR含量為指標(biāo)，考察大孔吸附樹脂對TSTR吸附的影響因素（樹脂徑高比、藥液質(zhì)量濃度、吸附體積流量、飽和吸附量）、解吸的影響因素（解吸溶劑體積分?jǐn)?shù)、解吸溶劑體積流量、解吸溶劑體積），篩選最優(yōu)工藝條件并進(jìn)行驗證及TSTR的純化制備。結(jié)果：以HPD100型大孔吸附樹脂對TSTR的吸附和解吸性能較佳；吸附的最優(yōu)工藝條件為樹脂柱徑高比 1 ∶ 5、藥液質(zhì)量濃度1 g/mL、吸附體積流量1 BV/h、飽和吸附量為1.25 g生藥/1 g HPD100樹脂；解吸的最優(yōu)工藝條件為解吸溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、解吸體積流量3 BV/h、解吸溶劑體積5 BV；驗證工藝中TSTR的平均解吸保留率為77.96%（RSD=0.46%，n=3），最終所制備的TSTR干膏中TSTR的純度為52.47%（RSD=1.53%，n=3）。結(jié)論：該優(yōu)選純化工藝穩(wěn)定可行，可用于TSTR的分離純化。

關(guān)鍵詞 大孔吸附樹脂；分離；純化；赤雹根；總皂苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the separation and purification technology of total saponins from the root of Thladian- tha dubia （TSTR）. METHODS： The content of TSTR was determined by UV-visible spectrophotometry. By comparing static adsorption and desorption properties of different types （AB-8， D101， DM130， HPD100， HPD300， HPD450， HPD600， HPD826， NKA-9） of macroporous adsorption resin， the type of macroporous adsorption resin was screened. With the content of TSTR as the index， influential factors of macroporous adsorption resin for adsorbing （ratio of height to diameter of resin， mass concentration of medicine liquid， adsorption volume flow， saturated extent of adsorption） and desorbing （desorption solvent volume fraction， desorption solvent volume flow， volume of desorbed solvent） TSTR were investigated. The optimal technology was screened. The technology validation， purification and preparation were conducted. RESULTS： HPD100 type macroporous adsorption resin had good adsorption and desorption properties for TSTR. The optimal adsorption technology was that the ratio of the height to diameter of the resin column was 1 ∶ 5； mass concentration of medicine liquid was 1 g/mL； adsorption volume flow rate was 1 BV/h； saturated adsorption capacity was 1.25 g per 1 g HPD100 resin； the optimal desorption technology was that the volume fraction of desorption solvent ethanol was 75%； volume flow rate of desorption was 3 BV/h； the volume of desorption solvent was 5 BV. The average desorption retention rate of TSTR was 77.96% in technology validation （RSD=0.46%， n=3） and the purity of prepared TSTR in TSTR dry cream was 52.47% （RSD=1.53%， n=3）. CONCLUSIONS： The optimal purification technology is stable， feasible and suitable for the separation and purification of TSTR.

KEYWORDS Macroporous adsorption resin； Separation； Purification； Root of Thladiantha dubia； Total saponins

赤雹根為葫蘆科多年蔓生草本植物赤雹（Thladiantha dubia Bunge）的干燥成熟塊根，味苦性寒，具有活血祛瘀、清熱解毒、通乳等作用，滿族民間常用于治療風(fēng)濕痹痛、腰腿痛、痛經(jīng)及軟組織損傷等[1]。前期研究結(jié)果證實赤雹根鎮(zhèn)痛作用的主要有效部位為赤雹根總皂苷（TSTR）[1-2]，且TSTR對佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠有較好的治療作用，并能抑制炎癥因子的表達(dá)，延緩滑膜病變的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。目前對于皂苷類成分的提取有多種方法，其中樹脂吸附法有可選擇性吸附、容易再生、可重復(fù)使用等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于皂苷類成分的分離和富集。因此，本研究選擇9種樹脂進(jìn)行吸附、解吸試驗，最終確立TSTR分離純化的最優(yōu)工藝條件，為TSTR后續(xù)的開發(fā)和利用提供一定的試驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HP-8453型紫外-可見分光光度儀（美國惠普公司）；GL-20B型冷凍離心儀（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GT16-3型高速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；YP1200型電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；AG245型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海東星建材試驗設(shè)備有限公司）。

1.2 藥材、藥品、樹脂與試劑

赤雹根藥材（2013年10月采集于河北省青龍滿族自治縣，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所趙春穎教授鑒定，確認(rèn)為葫蘆科植物赤雹的成熟干燥塊根）；齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206，純度：99.7%）；大孔吸附樹脂AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9（滄州寶恩吸附材料科技有限公司，批號：20160309、20160419、20160309、20160422、20160420、20151125、20160325、20151225、20160419）；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外-可見分光光度法測定TSTR含量

TSTR樣品溶液的含量測定方法依據(jù)本實驗室前期建立的紫外-可見分光光法[6]。

2.1.1 TSTR樣品溶液的制備 取赤雹根藥材適量，置于圓底燒瓶中并加入70%乙醇浸泡過夜，在80 ℃下回流提取3次，每次1 h。合并3次所得提取液，抽濾，然后將濾液置于圓底燒瓶中，減壓濃縮，將濃縮液于烘箱中80 ℃烘干，得TSTR干膏，備用。加入適量水將所得干膏溶解即得TSTR樣品溶液（所含生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL）[6]。

2.1.2 方法學(xué)考察 根據(jù)相應(yīng)要求進(jìn)行方法學(xué)考察[6]。以吸光度值為縱坐標(biāo)（y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=0.055 9x-0.027 1（r=0.999 7），TSTR在質(zhì)量濃度為3.13～39.41 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。精密度試驗中RSD=0.67%（n=6），1.5 h內(nèi)穩(wěn)定性試驗中RSD=2.91%（n=6），重復(fù)性試驗中RSD=2.78%（n=6），平均加樣回收率為98.9%（RSD=1.99%，n=6），均符合相關(guān)要求。

2.1.3 樣品含量測定 準(zhǔn)確移取“2.1.1”項下TSTR樣品溶液1 mL置于10 mL EP管中，在545 nm波長處測定吸光度值。經(jīng)計算干膏中TSTR純度為30.92%。

2.2 大孔吸附樹脂型號的篩選

2.2.1 大孔吸附樹脂的類型選擇 根據(jù)TSTR的理化性質(zhì)以及大孔吸附樹脂的吸附性能，選用AB-8、D101、DM130、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD826、NKA-9共9種型號的大孔吸附樹脂進(jìn)行試驗。將上述9種樹脂分別用95%乙醇浸泡過夜，除去上層乙醇，濕法裝柱，用95%乙醇先以2 BV/h的流速洗至流出液加3 BV純水不再產(chǎn)生渾濁為止，然后用水洗至流出液無醇味，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附、解吸性能比較 精密稱取預(yù)處理后的9種大孔吸附樹脂各5 g，精密加入稀釋至0.95 mg/mL（以生藥計）TSTR樣品溶液23 mL，每10 min振搖1次（每次持續(xù)1 min），連續(xù)2 h，然后靜置24 h，過濾，收集吸附后濾液，測定每份濾液的吸光度，代入回歸方程得出濾液中TSTR的質(zhì)量濃度，然后計算每份的比吸附量和吸附率。分別將過濾后的樹脂重新分別置于9只錐形瓶內(nèi)，依次準(zhǔn)確加入20 mL 70%乙醇，每10 min振搖1次（持續(xù)1 min），連續(xù)2 h，靜置8 h后，過濾，測定濾液中TSTR的質(zhì)量濃度，并計算其比解吸量和解吸率。設(shè)定吸附前藥液中總皂苷質(zhì)量為m1、流出液中總皂苷質(zhì)量m2、解吸液中總皂苷質(zhì)量為m3、濕樹脂量為m4，則比吸附量=（m1-m2）/m4；吸附率=（m1-m2）/m1×100%；比解吸量=m3/m4；解吸率=m3/（m1-m2）。9種大孔吸附樹脂對TSTR的吸附、解吸性能見表1。

由表1可知，HPD100與HPD826的比解吸量分別為30.36、33.58 mg/g，均高于其他7種型號的樹脂，其中HPD100的比吸附量和吸附率分別為50.68 mg/g、52.84%，HPD100的比吸附量和吸附率均高于其余8種型號的樹脂。故采用HPD100型大孔吸附樹脂純化富集TSTR。

2.3 HPD100型大孔吸附樹脂對TSTR吸附的影響因素考察

2.3.1 樹脂徑高比、藥液質(zhì)量濃度及吸附體積流量 根據(jù)預(yù)試驗，以溶液中的TSTR質(zhì)量為考察指標(biāo)，選擇對HPD100型大孔吸附樹脂吸附TSTR可能產(chǎn)生影響的樹脂柱徑高比、藥液質(zhì)量濃度（以生藥計）、吸附體積流量為考察因素設(shè)計正交試驗，各組均取“2.1.1”項下TSTR樣品溶液3 mL。正交試驗因素與水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3、表4可知，各因素對試驗結(jié)果的影響程度依次為B>A>C，其中因素B對試驗結(jié)果具有顯著影響（P<0.05）。由此確定最佳組合為A2B3C2，由于因素C對試驗結(jié)果的影響最小，出于降低成本的要求，確定最終最佳水平組合為A2B3C1，即樹脂柱徑高比為1 ∶ 5，藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，吸附體積流量為1 BV/h。

2.3.2 飽和吸附量的確定 取20 g HPD100型大孔吸附樹脂，經(jīng)預(yù)處理后濕法裝柱，備用。準(zhǔn)確移取“2.1.1”項下1.0 g/mL（以生藥計）TSTR樣品溶液100 mL，在樹脂柱徑高比為1 ∶ 5，藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，吸附體積流量為1 BV/h條件下裝柱、上樣，每5 mL作為1個流分，等體積收集16份。按“2.1”項下方法操作并計算每一流分中TSTR的質(zhì)量，以收集的流分序號為橫坐標(biāo)，以TSTR的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，并繪制泄漏曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，從流分6開始樹脂柱出現(xiàn)明顯的泄露現(xiàn)象，流分6中TSTR的質(zhì)量是流分5中的3.3倍，故20 g HPD100型大孔樹脂吸附上樣液的最大體積為25 mL，即相當(dāng)于25 g生藥，因此，可推知HPD100型大孔樹脂的飽和吸附量為每1 g樹脂可吸附1.25 g生藥。

2.4 HPD100型大孔樹脂對TSTR解吸附的影響因素考察

2.4.1 解吸溶劑體積分?jǐn)?shù)的考察 取40 g預(yù)處理后的HPD100型大孔樹脂，濕法裝柱。量取50 mL質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥計）的TSTR樣品溶液，以1 BV/h的流速通過樹脂柱，先用純水洗至Molish反應(yīng)為陰性，然后依次用1 BV體積分?jǐn)?shù)為15%、30%、45%、60%、75%、90%乙醇，以3 BV/h的流速洗脫，每21 mL作為1個流分，等體積收集18份。從每個流分中精密移取1 mL置于10 mL EP管中，按“2.1”項下方法操作并計算每一流分中TSTR的質(zhì)量，以收集的流分序號為橫坐標(biāo)，以TSTR的質(zhì)量為縱坐標(biāo)，并繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，TSTR主要集中在60%～75%乙醇洗脫液中，總量占全部乙醇洗脫液中TSTR質(zhì)量的66.54%。由于75%乙醇具有良好的洗脫能力，而90%乙醇洗脫液中TSTR含量偏低，僅占TSTR總量的7.97%，從經(jīng)濟成本考慮，洗脫時先用純水洗去糖類等極性大的雜質(zhì)，再用30%乙醇溶液洗去極性較大的雜質(zhì)，最后用75%乙醇溶液洗脫TSTR。

2.4.2 解吸溶劑體積流量的考察 按照以上優(yōu)化條件裝4根HPD100型大孔吸附樹脂柱，準(zhǔn)確量取4份等體積質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥計）的上樣液，以1 BV/h的流速通過樹脂柱，先用5.5 BV的純水洗脫至Molish反應(yīng)為陰性。然后分別用8 BV的75%乙醇以1、2、3、4 BV/h的解吸體積流量進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每份精密移取1 mL置于10 mL EP管中，按照“2.1”項下方法操作并計算每一流分中TSTR的質(zhì)量，結(jié)果，當(dāng)解吸體積流量分別為1、2、3、4 BV/h時，TSTR質(zhì)量分別為106.31、106.73、109.66、106.99 mg。

當(dāng)解吸體積流量為3 BV/h時，洗脫液中TSTR質(zhì)量最大為109.66 mg，解吸體積流量從1～3 BV/h時，所得到TSTR的質(zhì)量與解吸體積流量的大小呈正相關(guān)關(guān)系，解吸體積流量增大至4 BV/h時，所得到TSTR的質(zhì)量開始下降，所以最佳的解吸體積流量為3 BV/h。

2.4.3 解吸溶劑體積的考察 精密量取13 mL質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥計）的上樣液，按照以上優(yōu)化條件進(jìn)行試驗，吸附完全后，先用5.5 BV的純水洗至Molish反應(yīng)為陰性，然后用75%乙醇以3 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，流出液每流出1 BV時精確移取1 mL于10 mL EP管中，連續(xù)取樣7次，按照“2.1”項下方法操作并計算每一流分（解吸溶劑體積為1、2、3、4、5、6、7 BV時）中TSTR的質(zhì)量，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)解吸溶劑體積為7 BV時流出液中TSTR的質(zhì)量是最大的，從5～7 BV解吸曲線增高趨勢變緩，最終所得TSTR的質(zhì)量相差不大，從經(jīng)濟成本上考慮，解吸時解吸溶劑的體積為5 BV時較佳。

2.5 工藝驗證試驗

配制質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥計）的TSTR樣品溶液30 mL，取3根樹脂柱用HPD100型大孔樹脂濕法裝柱，經(jīng)預(yù)處理后，各取10 mL樣品溶液過樹脂柱，樹脂柱徑高比為1 ∶ 5，藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，吸附體積流量為1 BV/h條件進(jìn)行吸附，5.5 BV純水洗去極性較大的雜質(zhì)，然后再用5 BV的75%乙醇溶液洗脫，分別收集乙醇洗脫液。按“2.1”項下方法操作并計算每一份洗脫液中TSTR的質(zhì)量并計算解吸保留率（洗脫后TSTR的質(zhì)量/吸附量×100%），結(jié)果見表5。

表5 TSTR的解吸保留率計算結(jié)果（n=3）

Tab 5 Results of desorption retention of TSTR（n=3）

[編號 樣品溶液中TSTR

的質(zhì)量，mg 吸附量，

mg 洗脫后TSTR

的質(zhì)量，mg 解吸保留

率，% 平均解吸保

留率，% RSD，

% 1 237.30 135.74 106.24 78.27 2 237.30 135.74 105.30 77.57 77.96 0.46 3 237.30 135.74 105.93 78.04 ]

前期試驗證實，10 mL（含生藥1.0 mg/mL）的上樣液過徑高比1 ∶ 5的HPD100型大孔樹脂柱的解析保留率為57.20% 。由表5可知，當(dāng)上樣液為10 mL時，TSTR的平均解吸保留率為77.96%（RSD=0.46%，n=3），說明用HPD100型大孔樹脂富集純化TSTR的最優(yōu)工藝穩(wěn)定可行。

2.6 TSTR的制備

取赤雹根生藥材700 g（即生藥量為700 g），按“2.1.1”項下方法制備TSTR干膏，按照樹脂柱徑高比為1 ∶ 5，藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL，吸附體積流量為1 BV/h純化工藝裝柱、上樣，依次用5.5 BV純水、4 BV 30%乙醇、5 BV 75%乙醇洗脫，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮，濃縮液于80 ℃烘箱中烘干，并測定其中TSTR的純度，結(jié)果見表6。

由表6可知，所制備的TSTR干膏中TSTR的純度為52.47%（RSD=1.53%，n=3），純度大于50%，說明采用本法富集、純化TSTR的工藝合理、可行。

3 討論

大孔樹脂為一類新型非離子型高分子化合物，能夠選擇性吸附有機物，具有吸附容量大、解吸速度快、洗脫率高、再生容易等優(yōu)點[7-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，用大孔吸附樹脂富集、純化玉竹、人參、木瓜、黃芪等總皂苷效果較為理想[11-14]。目前已廣泛應(yīng)用于天然藥物的分離與富集，尤其適用于水溶性化合物，如皂苷、黃酮等成分。

樹脂徑高比、藥液質(zhì)量濃度及吸附體積流量，這三者可以直接影響大孔吸附樹脂的吸附性能。合理的徑高比可以提高樹脂對植物有效成分的吸附與分離。對于藥液質(zhì)量濃度，若藥液質(zhì)量濃度過高，則黏度較大，被吸附的物質(zhì)往樹脂內(nèi)部擴散傳質(zhì)速度變慢，雜質(zhì)與有效成分或有效成分之間產(chǎn)生競爭吸附，易導(dǎo)致樹脂過飽和；若藥液質(zhì)量濃度過低，則黏度較小，在一定上樣流速下溶液通過柱床流速較快，大于傳質(zhì)速度，傳質(zhì)未進(jìn)行徹底即可能泄露[15]。對于吸附體積流量，若流量過快時，可能會導(dǎo)致樹脂對樣品有效成分吸附不充分，從而造成樣品有效成分的泄露；流量過慢時，吸附速率會下降，時間消耗增加，使生產(chǎn)周期延長，成本提高。因此，本試驗考察樹脂徑高比、藥液質(zhì)量濃度及吸附體積流量這3種因素的不同水平對結(jié)果的影響，得出3因素的最優(yōu)水平組合為樹脂柱徑高比為1 ∶ 5，藥液質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥計），吸附體積流量為1 BV/h。

赤雹根的主要成分為三萜皂苷類成分，迄今為止已經(jīng)從赤雹根中分離并鑒定出多個皂苷類成分，主要為齊墩果酸類化合物。本試驗對9種具有極性、非極性及弱極性的大孔吸附樹脂對TSTR的吸附、解吸性能進(jìn)行了考察，確定了HPD100型大孔吸附樹脂分離純化TSTR的效果比較理想，通過梯度洗脫，先采用低濃度30%乙醇溶液洗去極性較大的雜質(zhì)，然后再用75%乙醇溶液洗脫獲得純度為52.47%的TSTR。由于30%乙醇洗脫液中含有一定量的皂苷，故將30%乙醇洗脫液收集，濃縮，80 ℃烘干后得到干膏，用于進(jìn)一步的分離純化研究。從結(jié)果上分析，TSTR的含量由原來的干膏中的30.92%提高到洗脫物中的52.47%，純化工藝穩(wěn)定可行。

綜上分析，HPD100型大孔吸附樹脂對TSTR具有良好的純化性能，且工藝條件穩(wěn)定，可為TSTR的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考，同時也為TSTR類物質(zhì)的分離、鑒定及其應(yīng)用研究提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2017-04-09 修回日期：2017-12-11）

（編輯：劉明偉）