單劑量順鉑對大鼠腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的影響

陸斯斯　鐘小斌　楊玉芳　鄒小琴　梁雪艷　蔡果珍

中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）03-0298-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.03

摘 要 目的：探討單劑量順鉑對大鼠腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的影響。方法：將72只SD大鼠隨機(jī)分為正常組和順鉑組，每組36只。正常組與順鉑組大鼠于實驗第1天分別單次腹腔注射等體積生理鹽水、順鉑5 mg/kg，于實驗第8、14、30、50、60、90天分別處死6只大鼠，測定血清尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平，檢測腎小管間質(zhì)損傷程度、腎小管間質(zhì)纖維化相對面積和腎組織中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，順鉑組大鼠各時間點血清BUN和Cr水平、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、腎小管間質(zhì)纖維化相對面積和腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05或P<0.01）。在順鉑組中，在第8～90天內(nèi)，大鼠血清BUN水平無明顯變化，血清Cr水平、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、腎小管間質(zhì)纖維化相對面積和腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)水平均呈先升高后降低趨勢。結(jié)論：臨床劑量的順鉑單次給藥可誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與其腎組織中TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 順鉑；腎間質(zhì)纖維化；α-平滑肌肌動蛋白；Ⅰ型膠原蛋白；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To discuss the effects of single dose of cisplatin on renal interstitial fibrosis indicators in rats dynamically. METHODS： 72 SD rats were randomly divided into normal group and cisplatin group， with 36 rats in each group. Normal group and cisplatin group were given equal volume of normal saline and cisplatin 5 mg/kg intraperitoneally on the first day， respectively. Each 6 rats were sacrificed on 8th， 14th， 30th， 50th， 60th， 90th day. The serum levels of blood urea nitrogen （BUN） and creatinine （Cr） were determined， and the degree of renal tubulointerstitial injury and relative area of renal tubulointerstitial fibrosis were evaluated. The expression of α-smooth muscle actin （α-SMA）， type I collagen （Col Ⅰ） and transforming growth factor β1 （TGF-β1） were determined in renal tissue. RESULTS： Compared with normal group， the serum levels of BUN and Cr， renal tubulointerstitial injury indexes， relative area of renal tubulointerstitial fibrosis， and the expression of α-SMA， Col Ⅰ and TGF-β1 in renal tissue were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. In cisplatin group， within the 8th-90th days， serum level of BUN in rats had no significant change； serum level of Cr， renal tubulointerstitial injury indexes， renal tubulointerstitial fibrosis， the expression of α-SMA， Col Ⅰ and TGF-β1 in renal tissue increased first and then decreased. CONCLUSIONS： A single dose of clinical dose of cisplatin can induce renal interstitial fibrosis in rats， and its mechanism may be related to the expression of TGF-β1 in renal tissue.

KEYWORDS Cisplatin； Renal interstitial fibrosis； α-SMA； Col Ⅰ； TGF-β1； Rat

順鉑是治療實體瘤最常用和最有效的化療藥物之一，同時也是聯(lián)合化療中最常用的抗腫瘤藥物[1-2]，但腎毒性是順鉑的主要不良反應(yīng)之一[3-4]。順鉑的腎毒性主要表現(xiàn)為腎小管及腎小管間質(zhì)的損傷，有報道稱連續(xù)用藥可發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化[5]。腎間質(zhì)纖維化的特征是成纖維細(xì)胞和（或）腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）[6]。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物[7]。此外，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是最重要的促纖維化細(xì)胞因子之一[8]。腎間質(zhì)纖維化形成的主要原因是ECM合成和降解失衡，造成其大量積聚，Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）是ECM重要成分之一[9]。

有報道，單次臨床常用劑量的順鉑（換算成大鼠劑量）可引起大鼠急性腎損害[10]，但急性腎損害之后是否可引起腎間質(zhì)纖維化的研究卻鮮有報道。本實驗單次給予大鼠腹腔注射臨床常用劑量的順鉑，通過觀察不同時間點大鼠腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)的變化情況，探討單劑量順鉑對大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響。

1 材料

1.1 儀器

7100型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；CX-31型正置顯微鏡（日本Olympus公司）；TDL-5A型離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用順鉑（凍干型，齊魯制藥有限公司，批號：3040101DBDB，規(guī)格：每支10 mg）；尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：C013-2、C011-1）；戊巴比妥鈉（德國Merck公司，批號：P11011，規(guī)格：每瓶5 g，純度：>99%）；兔源α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1的多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；通用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）檢測試劑盒[北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：SP-9000，組分：封閉用正常山羊血清工作液、生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶素卵白素工作液]。

1.3 動物

SD大鼠，♂，SPF級，體質(zhì)量為（200±20）g，6～7周齡，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002。

2 方法

2.1 分組與給藥

72只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組和順鉑組，每組36只。正常組大鼠于實驗第1天單次腹腔注射等體積生理鹽水。順鉑組大鼠于實驗第1天單次腹腔注射順鉑5 mg/kg（用生理鹽水將注射用順鉑配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的順鉑溶液）。實驗期間大鼠自由攝食飲水。

2.2 大鼠體質(zhì)量測定

分別于給藥前及實驗第8、14、30、50、60、90天稱量所有大鼠的體質(zhì)量。

2.3 標(biāo)本采集及處理

分別于實驗第8、14、30、50、60、90天處死大鼠，每個時間點處死6只。大鼠處死前禁食不禁水12 h，以戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5 mL，以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心15 min，分離血清，于-80 ℃保存，用于檢測血清BUN和Cr水平。然后取出左側(cè)腎臟，剝離包膜，置于4%甲醛中固定，石蠟包埋切片，用于檢測腎小管間質(zhì)損傷、腎小管間質(zhì)纖維化和腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)水平。

2.4 血清BUN和Cr的檢測

采用全自動生化分析儀測定血清BUN和Cr水平。

2.5 腎小管間質(zhì)損傷評分

取腎組織切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，于400倍鏡下單盲依序分別選取左上、左下、右上、右下、中間5個腎小管視野，依據(jù)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腎小管擴(kuò)張、腎小管萎縮、紅細(xì)胞管型、蛋白管型、間質(zhì)水腫、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等8項標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評分，計算其均值作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)[11]，腎小管間質(zhì)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.6 腎小管間質(zhì)纖維化評價

腎組織切片經(jīng)Masson染色后，于400倍鏡下隨機(jī)選取5個互不重疊的腎小管間質(zhì)視野，分別測量每個視野中腎小管間質(zhì)纖維化的相對面積，取平均值進(jìn)行半定量分析[12]。

2.7 腎組織中α-SMA、Col Ⅰ和TGF-β1表達(dá)的檢測

采用免疫組化SP法檢測腎組織中α-SMA、Col Ⅰ和TGF-β1表達(dá)水平。腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，置于0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液中高壓修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉非特異性抗原，分別滴加兔源α-SMA（1 ∶ 3 000）、Col Ⅰ（1 ∶ 1 000）、TGF-β1（1 ∶ 3 000） 多克隆抗體，4 ℃過夜，滴加二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG），37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS洗3次。用顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、脫水、透明、封片。每張切片隨機(jī)拍攝5個高倍視野照片，采用Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件，計算其平均光密度值后求平均值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，同一時間點兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)不同時間點比較采用方差分析（ANOVA）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量

順鉑組大鼠實驗第8、14、30、50、60、90天的體質(zhì)量均低于正常組相同時間點，其中第30、50、60、90天的體質(zhì)量降低差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明順鉑給藥后可降低大鼠的體質(zhì)量。兩組大鼠各時間點的體質(zhì)量測定結(jié)果見圖1。

3.2 血清BUN和Cr水平

正常組大鼠給藥后各時間點血清BUN和Cr水平無明顯變化。順鉑組大鼠實驗第8、14、30、50、60、90天的血清BUN和Cr水平均明顯高于正常組相同時間點（P<0.05或P<0.01）。隨著時間的延長，順鉑組大鼠血清BUN水平無明顯變化；Cr水平于第8天急劇升高，與第8天比較，除第90天外其余各時間點的血清Cr水平明顯降低（P<0.05或P<0.01）。兩組大鼠給藥后各時間點血清BUN和Cr水平測定結(jié)果見圖2。

3.3 腎小管間質(zhì)損傷

HE染色發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠給藥后各時間點的腎組織結(jié)構(gòu)未見異常。順鉑組大鼠在實驗第8天，腎間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，局部可見腎小管上皮細(xì)胞脫落，出現(xiàn)蛋白管型、紅細(xì)胞管型；隨著時間的延長，腎組織的損傷呈先加重后減輕的趨勢，逐漸出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張、萎縮，在皮質(zhì)髓質(zhì)區(qū)有纖維組織增生，第60、90天時腎小管間質(zhì)損傷開始減輕。兩組大鼠給藥后各時間點腎組織HE染色圖片見圖3。

通過腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，順鉑組實驗第8、14、30、50、60、90天的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)均明顯高于正常組相同時間點（P<0.01）。隨著時間的延長，順鉑組大鼠的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)呈先升高后降低的趨勢，第50天時達(dá)最高值，第60、90天突然下降，且第60天的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)明顯低于第50天（P<0.05），第60天與第90天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組大鼠給藥后各時間點腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)測定結(jié)果見圖4。

3.4 腎小管間質(zhì)纖維化

Masson染色發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠給藥后各時間點的腎組織結(jié)構(gòu)未見異常纖維增生。順鉑組大鼠實驗第8天可見纖維組織增生，隨著時間的延長，腎間質(zhì)纖維增生程度呈先加重后減輕的趨勢。兩組大鼠給藥后各時間點腎組織Masson染色圖片見圖5。

通過腎小管間質(zhì)纖維化相對面積的半定量分析發(fā)現(xiàn)，順鉑組實驗第8、14、30、50、60、90天的腎小管間質(zhì)纖維化相對面積明顯大于正常組相同時間點（P<0.05）；隨著時間的延長，腎小管間質(zhì)纖維化相對面積呈先增加后減小趨勢，第50天時達(dá)最高值，第60、90天突然下降，且第60天的腎小管間質(zhì)纖維化相對面積明顯小于第50天（P<0.05），第60天與第90天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組大鼠各時間點腎小管間質(zhì)纖維化相對面積測定結(jié)果見圖6。

3.5 腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)

α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1主要在腎小管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。正常組大鼠給藥后各時間點腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1均呈低水平表達(dá)，且各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。順鉑組大鼠實驗第8、14、30、50、60、90天腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)水平均明顯高于正常組相同時間點（P<0.05或P<0.01）。隨著時間的延長，順鉑組大鼠腎組織中α-SMA、Col Ⅰ、TGF-β1表達(dá)水平均呈先升高后降低趨勢，均于第50天達(dá)最高值。與第8天比較，順鉑組大鼠第30和50天的α-SMA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），其余各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；第50天的Col Ⅰ和TGF-β1表達(dá)水平明顯升高（P<0.05），第60和90天的Col Ⅰ表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。兩組大鼠各時間點腎組織中α-SMA、Col Ⅰ和TGF-β1表達(dá)的測定結(jié)果見圖7。

4 討論

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)全球終末期腎病發(fā)病率不斷升高。腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎病的共同階段，最終發(fā)展為終末期腎病。順鉑是腎損傷的主要藥物之一，隨著全球惡性腫瘤的發(fā)病率不斷升高，順鉑作為臨床最常用化療藥物之一，其引起腎損傷的患者勢必不斷增加。本課題組的研究和文獻(xiàn)[13-14]報道均證實順鉑單次臨床劑量換算成的大鼠劑量可引起大鼠急性腎損傷，然而大鼠急性腎損害過后是否發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化等的研究較少。本實驗給予SD大鼠單次腹腔注射順鉑5 mg/kg（由成人常用的單次臨床劑量換算），觀察腎損傷急性期后不同時間點的腎功能和腎間質(zhì)纖維增生情況。

在本實驗中，大鼠體質(zhì)量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)順鉑可降低大鼠的體質(zhì)量，其中實驗第30、50、60、90天的體質(zhì)量明顯降低（P<0.05）。說明隨著時間的延長，順鉑降低大鼠的體質(zhì)量的程度逐漸加重。

與正常組大鼠比較，順鉑組大鼠給藥后各時間點的血清BUN和Cr等腎功能指標(biāo)顯著升高（P<0.05或P<0.01） ，提示順鉑對大鼠腎功能損傷一直存在，在第60天甚至在第90天仍未恢復(fù)正常。

HE染色顯示，給藥后各時間點順鉑組大鼠的腎組織均出現(xiàn)損傷，而且隨著時間的延長，腎間質(zhì)損傷逐漸加重；實驗第60天時腎間質(zhì)損傷較前面的時間點有所減輕，但之后直到第90天腎間質(zhì)損傷并沒有進(jìn)一步的改善，且仍顯著高于正常組。

Masson染色發(fā)現(xiàn)，給藥后各時間點順鉑組大鼠的腎間質(zhì)均出現(xiàn)纖維增生；且隨著時間的延長，纖維增生逐漸加重；實驗第60天的腎間質(zhì)纖維增生較前面時間點的有所減輕，但之后直到第90天纖維增生沒有進(jìn)一步的減少，且仍顯著高于正常組。

Col Ⅰ是間質(zhì)中重要的ECM。α-SMA是肌成纖維母細(xì)胞的標(biāo)記分子，肌成纖維母細(xì)胞是ECM合成的主要細(xì)胞。α-SMA在腎組織中表達(dá)升高，說明腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，從而增加Col Ⅰ的合成[15]。本實驗的免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，順鉑組大鼠給藥后腎組織的α-SMA和Col Ⅰ水平顯著高于正常組，且隨著時間的延長，這些指標(biāo)的水平逐漸升高；雖然在實驗第60天較其前面時間點有所降低，但之后直至第90天沒有進(jìn)一步降低。這些指標(biāo)的變化與Masson染色結(jié)果的變化相一致。以上結(jié)果說明單次順鉑劑量（由成人單次臨床劑量換算成）可誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化。有報道大鼠腹腔注射單劑量順鉑6 mg/kg，第7天膠原沉積逐漸增加，第14天可見明顯腎間質(zhì)纖維化[16]，多次給藥可加重腎間質(zhì)纖維化[5]。以上報道與本實驗結(jié)果相似。

TGF-β1是目前公認(rèn)的最重要的致纖維化細(xì)胞因子之一，其在腎纖維化的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。TGF-β1能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，α-SMA能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，從而使腎間質(zhì)中的ECM成分沉積，最終導(dǎo)致腎纖維化[17-18]。在本實驗中，大鼠順鉑暴露后，腎組織TGF-β1水平在各時間點均顯著高于正常組；而且隨著時間的延長，TGF-β1水平逐漸升高，雖然第60天時TGF-β1水平較前有所下降，但之后直至第90天沒有進(jìn)一步降低。TGF-β1水平與HE染色結(jié)果、Masson染色結(jié)果、α-SMA以及Col Ⅰ等的水平變化情況相一致。

綜上所述，臨床單劑量順鉑可誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)纖維化，其機(jī)制可能與其上調(diào)腎組織中TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2017-09-08 修回日期：2017-12-15）

（編輯：鄒麗娟）