節(jié)律基因Clif單核苷酸多態(tài)性與漢族人群急性心肌梗死的關(guān)聯(lián)分析

陳晨 江舟 程敏 曹麗萍 周剛 王正榮四川省科學(xué)城醫(yī)院（四川綿陽(yáng)6900）；四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究室（成都 6004）；衛(wèi)生部時(shí)間生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 6004）

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)近年隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)病率逐年升高，成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleo?tide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異所導(dǎo)致的一種DNA序列多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)AMI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與易感基因的SNP密切相關(guān)［1-2］。通過(guò)病例-對(duì)照的突變分析，搞清這類(lèi)SNP與異常表型之間的關(guān)系，進(jìn)而闡明AMI的遺傳機(jī)制。近年的研究表明，近日節(jié)律鐘基因多態(tài)性確實(shí)與許多疾病的發(fā)病存在某些關(guān)聯(lián)。通過(guò)回顧國(guó)內(nèi)外的研究，筆者發(fā)現(xiàn)以下節(jié)律基因的SNP位點(diǎn)與眾多軀體疾病密切相關(guān)。例如：clock、clif及npas2等都存在SNP位點(diǎn)與睡眠相位波動(dòng)、孤獨(dú)、季節(jié)性情感障礙、雙向抑郁等疾病發(fā)生相關(guān)［3-5］；bmal1與clock還與不孕不育有關(guān)聯(lián)［6］；period1、period3與海洛因、可卡因、冰毒等成癮性關(guān)系密切［7］。近日鐘基因的突變或表達(dá)異常常導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。BRAY等［8］對(duì)clock突變的小鼠心肌收縮力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)clock基因突變后小鼠的心肌收縮力、代謝功能以及相關(guān)基因表達(dá)均發(fā)生了改變，也就是說(shuō)當(dāng)clock基因突變時(shí)易導(dǎo)致小鼠發(fā)生心血管疾病。TAKEDA等［9］采用基因芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)鐘控基因進(jìn)行了分析檢測(cè)，他們發(fā)表有229個(gè)基因其內(nèi)CLOCK/BMAL2上調(diào)，其中TM（凝血調(diào)節(jié)蛋白）也是受CLOCK/BMAL2調(diào)控的鐘控基因。為進(jìn)一步明確近日鐘基因在心肌缺血發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，本課題致力于節(jié)律基因Clif SNP與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析。筆者擬對(duì)AMI患者Clif基因多態(tài)性進(jìn)行多位點(diǎn)研究，為臨床AMI的防治提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院心內(nèi)科2014年6月至2016年1月確診的漢族急性心肌梗死患者120例作為病例組，年齡為38～84歲；并采集同期體檢中心的78例漢族健康人群作為對(duì)照組，年齡32～77歲。分別于清晨7：00時(shí)抽取5 mL抗凝血液進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)包括三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指標(biāo)，其中3 mL留作DNA分離進(jìn)行基因測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的收集均經(jīng)本醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可并獲得患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 普通PCR儀、電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BIO?RAD公司，NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)ThermoScientific公司，普通離心機(jī)及電熱恒溫水浴箱購(gòu)自北京永光明醫(yī)療儀器廠，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 總RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。人全基因組DNA提取試劑盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SMART?MMLV Reverse Transcrip?tase），熒光定量 PCR試劑盒（SYBR?Premix Ex TaqTMII kit）均購(gòu)自日本Takara公司。SNaPshot試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司。Pai?1（血漿纖溶酶原激活抑制物?1）和血栓素（thrombomodulin，Tm）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。節(jié)律基因 Clif（aryl hydrocarbon receptor nuclear transloca?tor like 2）慢病毒干擾試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海吉瑪公司。PCR擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。

1.4 DNA的提取 選取采集的新鮮血細(xì)胞，按照人全基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取各標(biāo)本中的全基因組DNA。隨后將DNA使用NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取每個(gè)樣本的全基因組濃度，并放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單堿基引物延伸法基因分型（SnapShot） 按照SnapShot試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物總體積 9 μL，Exol酶 0.1 μL，SAP buffer 0.1 μL，SAP 2 μL，加滅菌水至總體積12 μL。反應(yīng)條件：37℃1 h；75℃15 min。隨后進(jìn)行單堿基引物延伸，反應(yīng)體系：純化后產(chǎn)物1 μL，SNapShot Multi?plex 1 μL，SnapShot primer 0.2 μL，加滅菌水至總體積5 μL。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共25個(gè)循環(huán)。隨后采用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，取出凝膠在凝膠成像系統(tǒng)記錄并鑒定提取結(jié)果。

1.6 RNA干擾技術(shù) C57BL/6J小鼠購(gòu)自南京動(dòng)物模式研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。參照Clif基因慢病毒干擾試劑盒，采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clif基因的表達(dá)，并采用熒光定量PCR測(cè)定小鼠血漿Clif mRNA的表達(dá)水平變化。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 采用雙抗體夾心法測(cè)定慢病毒干擾前后小鼠血漿中PAI?1和血栓素（TM）蛋白含量的變化表達(dá)水平。主要原理如下：用純化的一抗包被微孔板，制成固相抗體，往微孔中加入血清，再加入與酶標(biāo)記過(guò)的二抗結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加顯色劑顯色。

1.8 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR反應(yīng) 收集各組小鼠的血漿，按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提標(biāo)本總RNA。用NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的總RNA進(jìn)行定量后，取1 μg總RNA按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription，RT）合成cDNA，隨后將cDNA放置-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡkit試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：SYBR?Pre?mix Ex TaqTMⅡMix 10 μL，正、反向引物（10 μmol）共2.0 μL，cDNA 1 μL，滅菌水7 μL，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火+延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，4℃冷卻30 min，反應(yīng)結(jié)束后置4℃保存。以Gapdh為內(nèi)參，采用2－△△CT方法［10］分析各基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列信息Tab.1 Sequence information of gene primers

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Statistical Program for Social Science 18.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用t檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蝾l率分析采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，研究對(duì)象與Hardy Weinberg平衡的符合程度、單個(gè)基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表卡方檢驗(yàn)，以95%可信區(qū)間（CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。以P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 觀察組與對(duì)照組臨床資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩組人群性別和年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而觀察組總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白指標(biāo)明顯高于對(duì)照組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示上述3項(xiàng)指標(biāo)與AMI發(fā)生密切相關(guān)。

表2 觀察組與對(duì)照組臨床資料統(tǒng)計(jì)比較Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

表2 觀察組與對(duì)照組臨床資料統(tǒng)計(jì)比較Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別觀察組對(duì)照組P值例數(shù)120 78年齡（歲）46.3±5.6 48.4±6.8 0.72性別（女/男）45/75 31/47 0.89 HDL?C（mmol/L）1.91±0.85 1.36±0.31 0.17 TC（mmol/L）4.49±1.03 2.84±0.76 0.005*TG（mmol/L）1.92±1.56 1.23±0.66 0.002*LDL?C（mmol/L）3.75±0.88 2.78±0.63＜0.001*

2.2 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布在觀察組與對(duì)照組中的比較 通過(guò)Hardy?Weinberg遺傳平衡對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明樣本選擇達(dá)到了Hardy?Weinberg遺傳平衡，表明本實(shí)驗(yàn)選擇的樣本具有代表性。觀察組與對(duì)照組中Clif基因的基因型頻率分布情況及其統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表3。結(jié)果表明，Clif基因rs2289709位點(diǎn)的基因型頻率分布在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而rs62758860位點(diǎn)基因型頻率分布在觀察組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對(duì)照組中的比較 觀察組與對(duì)照組中Clif基因的等位基因頻率分布情況及其統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表4。結(jié)果表明，Clif基因rs2289709位點(diǎn)的等位基因頻率分布在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而rs62758860位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.4 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化 采用小鼠尾靜脈注射干擾物，沉默小鼠Clif基因的表達(dá)，并采用熒光定量PCR測(cè)定上述基因mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果見(jiàn)圖1，以對(duì)照組小鼠血漿Clif的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組Clif的表達(dá)量為0.17±0.08；以對(duì)照組小鼠血漿PAI?1的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組PAI?1的表達(dá)量為0.39±0.12；以對(duì)照組小鼠血漿TM的表達(dá)量為1，則慢病毒轉(zhuǎn)染組TM的表達(dá)量為0.56±0.15。上述結(jié)果表明小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，Clif、PAI?1和TM基因表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。

表3 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率分布在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的比較Tab.3 Comparison of genotype frequency distribution of Clif gene polymorphic loci in experimental group and control group

表4 Clif基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率分布在觀察組與對(duì)照組中的比較Tab.4 Comparison of allele frequency distribution of Clif gene polymorphism in experimental group and control group

圖1 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化Fig.1 Changes of mRNA expression of Clif，Pai?1 and Tm genes in plasma after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice

2.5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿中蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血漿中PAI?1和TM蛋白水平，結(jié)果見(jiàn)表5。分析發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，其血漿PAI?1和TM蛋白水平均較對(duì)照組小鼠顯著降低（P＜0.05）。

表5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化Tab.5 Changes in plasma protein PAI?1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

表5 小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，血漿蛋白PAI?1和TM水平表達(dá)變化Tab.5 Changes in plasma protein PAI?1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

組別慢病毒轉(zhuǎn)染組對(duì)照組P值例數(shù)11 11 PAI?1 41.10±7.32 48.09±12.13 0.045 TM 17.47±3.35 22.58±4.96 0.047

3 討論

流行病學(xué)及時(shí)間生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大部分發(fā)生于早晨，表明近日節(jié)律對(duì)心肌梗死的發(fā)生有重要的影響。已經(jīng)報(bào)道的節(jié)律基因，如Bmal1與高血壓發(fā)病密切相關(guān)［11-12］。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)表現(xiàn)出典型的近日節(jié)律振蕩，腎素-血管緊張素系統(tǒng)在早晨功能表達(dá)升高。腎素-血管緊張素系統(tǒng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮的近日節(jié)律性有關(guān)聯(lián)。近日節(jié)律基因mPer2，dbp和Bmal1在鼠主動(dòng)脈表現(xiàn)出明顯的近日節(jié)律振蕩，予以血管緊張素II會(huì)發(fā)現(xiàn)上述基因的表達(dá)增加［13-14］。另外，還有報(bào)道指出在急性心肌梗死動(dòng)物心臟中mPer2，dbp，Bmal1和CLOCK基因表達(dá)水平明顯升高［15］。通常情況下，心血管系統(tǒng)的近日節(jié)律變化的規(guī)律可反映出心血管系統(tǒng)正常與否。

本課題通過(guò)對(duì)節(jié)律基因Clif單核苷酸多態(tài)性與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)漢族人AMI患者的Clif基因rs2289709位點(diǎn)的基因型分布頻率與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Clif基因rs2289709位點(diǎn)與AMI存在密切關(guān)聯(lián)。PAI?1是一種單鏈糖蛋白，當(dāng)其以活性狀態(tài)存在于血漿中時(shí)與血漿波基結(jié)合素結(jié)合，形成復(fù)合物提高其穩(wěn)定性，當(dāng)PAI?1活性存在時(shí)能有效的發(fā)揮其生理機(jī)能，降低血液的凝血傾向及血栓形成，防止血液在血管內(nèi)形成血栓［16-17］。TM是位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的糖蛋白，它具有清除凝血酶、活化血液中抗凝因子蛋白C的作用，在抗凝因子蛋白C等的協(xié)同作用下能促進(jìn)纖維蛋白的溶解從而降低血栓形成等作用［9，18］。PAI?1 和TM 是在凝血機(jī)制和血栓形成中發(fā)揮著重要作用的因子，當(dāng)PAI?1和TM二者的功能失調(diào)時(shí)，將導(dǎo)致血凝和抗血栓功能失調(diào)，特別是PAI?1和TM的基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，引起表達(dá)產(chǎn)生的PAI?1和TM減少，會(huì)造成抗凝血功能減弱，在血管中易形成血栓。

鐘控基因產(chǎn)物之一PAI?1（血漿纖溶蛋白溶酶原激活抑制因子?1）在正常情況下表現(xiàn)出近日節(jié)律。OHKURA等［19］對(duì)近日鐘基因突變小鼠的凝血和纖溶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)未突變小鼠在21：00纖溶活性最低；而在Clock突變小鼠中纖溶活性一直很低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)clock基因突變小鼠的PAI?1的近日節(jié)律消失；上述研究結(jié)果表明clock基因在調(diào)控PAI?1從而影響纖溶系統(tǒng)，進(jìn)而使影響凝血系統(tǒng)扮演著重要的角色?；谏鲜鼋Y(jié)論，我們推測(cè)節(jié)律基因Clif對(duì)PAI?1同樣具有調(diào)控作用。為此，本課題的深入研究通過(guò)小鼠體內(nèi)注射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，觀察干擾前后小鼠血漿中Clif、Pai?1和Tm基因mRNA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)射慢病毒Clif干擾質(zhì)粒后，其血漿PAI?1和TM蛋白水平均較對(duì)照組小鼠顯著降低。上述結(jié)果提示血漿PAI?1和TM亦受節(jié)律基因Clif的調(diào)控，Clif基因遺傳變異可引起PAI?1和TM等鐘控基因的節(jié)律消失，并造成血管中的血液易形成血栓。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)節(jié)律基因Clif單核苷酸多態(tài)性與漢族人群AMI的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)漢族人群中Clif基因rs2289709位點(diǎn)位點(diǎn)多態(tài)性與AMI存在明顯關(guān)聯(lián)。Clif基因表達(dá)下調(diào)將導(dǎo)致PAI?1和TM基因表達(dá)下調(diào)，從而引起血漿中PAI?1和TM水平下降，使血液易凝血而形成血栓。本研究結(jié)果也為闡釋AMI常發(fā)生于清晨這一近日節(jié)律的現(xiàn)象提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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