葉綠醇對(duì)小鼠骨骼肌代謝酶活性和肌纖維類(lèi)型的影響

林廈菁 束 剛 朱曉彤*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州510640；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640)

近年來(lái)一系列研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維的類(lèi)型直接決定了肉色、嫩度和肌內(nèi)脂肪含量等多數(shù)肉質(zhì)指標(biāo)，是影響肉品質(zhì)的核心因素之一[1-3]。因此，研究肌纖維類(lèi)型的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控對(duì)于改善肉品質(zhì)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。有研究表明，在對(duì)豬肉色評(píng)分時(shí)發(fā)現(xiàn)氧化型(Ⅰ型)肌纖維的比例與肉色評(píng)分中的紅度(a*)值呈正相關(guān)[4]。Leseigneur等[5]研究發(fā)現(xiàn)氧化型肌纖維的磷脂含量比酵解型肌纖維高；而且含Ⅰ型肌纖維高的肌肉，肌間脂肪含量高，具有更好的風(fēng)味和多汁性，而含Ⅱb型肌纖維高的肌肉，肉質(zhì)較差，甚至產(chǎn)生白肌肉(PSE)。De Souza等[6]證實(shí)，過(guò)氧化物酶增殖體激活受體α(PPARα)激動(dòng)劑可以使慢肌(Ⅰ型)中的PPARα的表達(dá)量提高，對(duì)于快肌(Ⅱ型)沒(méi)有作用。Russell等[7]發(fā)現(xiàn)，提高骨骼肌中的PPARα表達(dá)和線粒體內(nèi)脂肪酸氧化的相關(guān)酶的活性能夠引起肌纖維類(lèi)型從Ⅱ型轉(zhuǎn)化到Ⅰ型。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，葉綠醇與PPARα的激活密切相關(guān)，葉綠醇還可以直接作為配體激活PPARα。利用熒光素酶報(bào)告基因的研究發(fā)現(xiàn)，葉綠醇可以顯著激活PPARα，其激活效應(yīng)是植烷酸的4倍[8]。An等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠飼糧中添加葉綠醇可以激活PPARα，從而改善肥胖引起的代謝性疾病。因此，本研究擬通過(guò)在小鼠飼糧中添加葉綠醇，觀察其對(duì)小鼠肌肉代謝相關(guān)酶活性和肌纖維類(lèi)型變化的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

本試驗(yàn)所用的3周齡雄性昆明小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心?；A(chǔ)飼糧由該中心提供，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。將飼糧粉碎后，分別在飼糧中添加0、0.05%、0.50%的葉綠醇以及0.48%硬脂酸，混勻后重新制料，37 ℃烘干。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平 (干物質(zhì)基礎(chǔ))

營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 主要材料與試劑

分析純?nèi)~綠醇購(gòu)自瑞鼎化工(上海)有限公司；甘油三酯(TG)、己糖激酶(HK)、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

40只3周齡雄性昆明小鼠[(13±1) g]經(jīng)過(guò)預(yù)飼后分為4組，每組10只,并單籠飼養(yǎng)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，陽(yáng)性對(duì)照組飼喂含0.48%硬脂酸的試驗(yàn)飼糧，2個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂含0.05%和0.50%葉綠醇的試驗(yàn)飼糧。小鼠在自然光照條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間自由飲水、采食，全期試驗(yàn)共計(jì)28 d。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，分離小鼠的腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌，濾紙吸干，稱(chēng)重，放入離心管中，迅速投入裝有液氮的液氮罐中。采樣結(jié)束后轉(zhuǎn)移樣品至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。檢測(cè)前，將解凍后的腓腸肌樣本用0.86%的冷生理鹽水小心漂洗，濾紙吸干水分，稱(chēng)重，轉(zhuǎn)入5 mL離心管，加入組織塊重量9倍體積的0.86%冷生理鹽水，在冰塊上將組織塊剪碎后勻漿。將制備的10%組織勻漿3 000 r/min低溫離心15 min，分裝上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)檢測(cè)

每周對(duì)小鼠進(jìn)行逐只稱(chēng)重，計(jì)算各組小鼠的平均體重。

1.5.2 腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量的測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束屠宰前，稱(chēng)量小鼠體重，屠宰后分離小鼠的腓腸肌、趾長(zhǎng)伸肌，濾紙吸干，稱(chēng)重，計(jì)算腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量，計(jì)算公式如下：

腓腸肌相對(duì)重量(%)=(腓腸肌重量/體重)×100；趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量(%)=

(趾長(zhǎng)伸肌重量/體重)×100。

1.5.3 腓腸肌中代謝生化指標(biāo)的檢測(cè)

采用比色法測(cè)定腓腸肌中TG含量和HK、LDH、SDH活性。上述指標(biāo)的檢測(cè)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀(Gene5多功能酶標(biāo)儀-BioTek，美國(guó))進(jìn)行吸光度測(cè)定。

1.5.4 肌纖維類(lèi)型組織學(xué)測(cè)定

參照Ashmore等[10]的酶組化法測(cè)定。切片制備：將用于組織化學(xué)分析的腓腸肌先從液氮轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，再轉(zhuǎn)入-30 ℃冰箱進(jìn)行逐步回溫，然后沿肌纖維垂直方向進(jìn)行冰凍切片(切片機(jī)，freezing microtome-Leica，德國(guó))，設(shè)置凍頭溫度-20 ℃，冷凍室溫度-25 ℃，切片厚度10 μm)，每個(gè)樣品切5張片。

每張切片利用五點(diǎn)法，深藍(lán)色為Ⅰ型肌纖維，淺藍(lán)為Ⅱa型肌纖維，白色為Ⅱb型肌纖維，在顯微鏡下(×100)觀察肌纖維并拍照，用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件對(duì)各類(lèi)型肌纖維比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠醇對(duì)小鼠平均體重的影響

由表2可知，在飼糧中添加0.50%葉綠醇時(shí)，前2周平均體重顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，此后逐漸恢復(fù)正常。

2.2 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.05%和0.50%葉綠醇均可顯著提高小鼠腓腸肌相對(duì)重量(P<0.05),對(duì)趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 葉綠醇對(duì)小鼠平均體重的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌和趾長(zhǎng)伸肌相對(duì)重量的影響

2.3 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌TG含量及代謝酶活性的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.50%葉綠醇顯著降低小鼠腓腸肌中TG的含量(P<0.05)，顯著提高HK活性(P<0.05)；添加0.05%葉綠醇顯著提高小鼠腓腸肌中SDH活性(P<0.05)；飼糧中添加葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌中LDH活性無(wú)顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加0.48%硬脂酸對(duì)上述代謝酶活性均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.4 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌肌纖維類(lèi)型的影響

由圖1和表5可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.50%的葉綠醇可以顯著提高小鼠腓腸肌肌纖維類(lèi)型中Ⅰ型肌纖維比例(P<0.05)，對(duì)于Ⅱa型與Ⅱb型肌纖維比例無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 葉綠醇對(duì)小鼠平均體重的影響

目前，葉綠醇對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)報(bào)道不多，且研究結(jié)果也不盡相同。Mackie等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加(0.5%、0.1%)的葉綠醇3周后，發(fā)現(xiàn)小鼠的體重顯著降低。Hashimoto等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，小鼠飼糧中添加0.5%葉綠醇可以降低小鼠的采食量，減緩小鼠體重的增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加0.50%葉綠醇飼養(yǎng)2周后，可以顯著降低小鼠的平均體重。這些試驗(yàn)結(jié)果與前人的結(jié)果基本一致，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

表4 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌TG含量及代謝酶活性的影響

圖1 小鼠腓腸肌ATP酶染色圖

%

3.2 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌代謝酶活性和TG含量的影響

肌肉的代謝類(lèi)型可大致分為氧化型、酵解型和中間型。Ⅰ型肌纖維的代謝類(lèi)型主要是氧化型，Ⅱ型肌纖維的代謝類(lèi)型主要酵解型[13]。在相同條件下，肌肉處于何種代謝類(lèi)型與肌肉的自身狀況有關(guān)，肌肉中LDH、SDH、HK活性能在一定程度上反映肌肉代謝狀況[14]。SDH是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，其活性一般可作為評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)。并且SDH與三羧酸循環(huán)的其他酶不同，是唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜的酶，是線粒體內(nèi)膜的一個(gè)重要部分[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，速度、爆發(fā)力訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員其快肌纖維選擇性肥大，而耐力訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員慢肌纖維選擇性肥大，肌肉中慢肌含量多，并且SDH的活性顯著提高[16]。Sieck等[17]測(cè)定大鼠膈肌中各肌纖維類(lèi)型中SDH的活性，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維中SDH活性最高。He等[18]研究同樣發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)人骨骼肌中3種肌纖維的SDH活性，其中Ⅰ型最高，Ⅱa型次之，Ⅱb型活性最低。HK為糖酵解的第一步酶，將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸，葡萄糖激酶是HK的異構(gòu)體。LDH是一種結(jié)合蛋白，其活性可反映細(xì)胞內(nèi)無(wú)氧酵解的活躍程度[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，比較豚鼠的紅股肌(Ⅱa型多)、白股肌(Ⅱb型多)、比目魚(yú)肌(Ⅰ型)3種肌肉中HK、LDH的活性，比目魚(yú)肌中LDH活性最低，白股肌中LDH活性最高，而HK活性恰好相反[20-21]。Peter等[22]對(duì)比豚鼠的白半膜肌和比目魚(yú)肌中LDH、HK活性，也得出相同的結(jié)果。以上結(jié)果提示，Ⅰ肌纖維中SDH、HK活性比Ⅱ型肌纖維高，同時(shí)LDH活性低于Ⅱ型肌纖維。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加葉綠醇可以提高小鼠腓腸肌中HK和SDH活性，說(shuō)明葉綠醇能夠提高肌肉中的氧化代謝酶活性，從而提高肌肉氧化代謝水平。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，0.50%葉綠醇組腓腸肌中TG含量顯著低于對(duì)照組。雖然以氧化型代謝為主的肌肉中肌內(nèi)脂肪含量較高[23]，但是這種觀點(diǎn)存在爭(zhēng)議。有試驗(yàn)證明，肌內(nèi)脂肪與肌肉代謝類(lèi)型沒(méi)有相關(guān)性[24]。氧化型肌肉中肌纖維脂質(zhì)含量比酵解型肌肉更高，但肌纖維中的脂質(zhì)含量相對(duì)脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)含量而言仍較少，因而肌內(nèi)脂肪的含量主要還是肌肉的脂肪細(xì)胞決定。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠飼喂4周0.2%和0.5%葉綠醇的飼糧，可以分別顯著降低肝臟的TG含量3倍和4倍[25]，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究相似，葉綠醇有減少組織TG含量的作用。

3.3 葉綠醇對(duì)小鼠腓腸肌肌纖維類(lèi)型的影響

肌纖維是組成肌肉的基本單位，肌纖維類(lèi)型組成差異是肉品質(zhì)變異的一個(gè)重要因素[26]，它與嫩度、pH、色差、持水力等肉品質(zhì)指標(biāo)存在重要的關(guān)系[27-31]，不同肌纖維類(lèi)型間的轉(zhuǎn)化可能成為肉質(zhì)改善的關(guān)鍵。高比例Ⅰ型肌纖維肌肉表現(xiàn)為較高的pH24 h和氧化酶活性,較低的酵解酶活性和滴水損失[32]。有研究表明，增加豬Ⅱ型肌纖維比例，可以增加宰后pH的下降、肉色亮度、肉色灰白、烹飪損失、蛋白質(zhì)變性程度，降低系水力[33-36]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加0.50%葉綠醇可以增加Ⅰ型肌纖維比例，說(shuō)明葉綠醇可能具有改善肉品質(zhì)的作用。

4 結(jié) 論

綜合本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加葉綠醇可以提高小鼠腓腸肌的相對(duì)重量，提高腓腸肌中HK和SDH活性，增加腓腸肌中Ⅰ型肌纖維的比例。