大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉對生長肉兔腸道形態(tài)、消化酶活性及盲腸發(fā)酵參數(shù)的影響

田 剛 魯院院 余 冰 曾繪錦 陳代文 羅玉衡 蔡景義

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都611130)

家兔作為一種小型節(jié)糧草食動物，飼糧中纖維質(zhì)量和含量與其健康密切相關[1]。目前，優(yōu)質(zhì)的苜蓿草粉可為家兔提供部分纖維，但其資源有限，價格昂貴，影響了養(yǎng)兔業(yè)的經(jīng)濟效益[2]。因此，新型粗飼料的開發(fā)具有重要意義。薏苡本身為禾本科植物，研究表明，不僅薏苡仁中富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，而且其根、莖、葉中同樣含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有極高的飼用價值[3-4]。此外，薏苡對治療胃腸道健康作用明顯[3-6]。薏苡胚乳及麩皮和去殼薏苡的乙醇提取物在保護胃腸道健康，調(diào)節(jié)腸道微生物方面有明顯效果[6-8]。薏苡仁可改善腸道的屏障功能，緩解腹瀉，增加腸道中的乳酸桿菌數(shù)量及揮發(fā)性脂肪酸含量[8-11]。生薏仁粉可促進小鼠胃腸動力，經(jīng)過中藥炮制方法麩炒后的薏仁粉具有止瀉的作用[12]。去殼發(fā)酵薏苡可以平衡倉鼠盲腸生物種群[13]。薏苡仁中的抗性淀粉可降低小鼠腸道中的致病菌數(shù)量，增加雙歧桿菌數(shù)量，改善腸道組織形態(tài)[14]。薏苡仁油復乳可促進腸道吸收[15]。同時青貯薏苡秸稈可促進纖維分解菌的繁殖[16]。綜上可見，薏苡仁及相關產(chǎn)品對腸道健康有一定的調(diào)節(jié)和保護作用，且在動物試驗中也獲得較好的生長性能[17-19]。但是目前薏苡應用于家兔飼糧中對其腸道健康的影響未見報道。經(jīng)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大黑山薏苡草粉營養(yǎng)成分豐富，對家兔具有較高的營養(yǎng)價值，并獲得了較理想的生長性能及養(yǎng)分消化率[17,19]。因此，本試驗在之前研究的基礎上，進一步研究大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對家兔腸道形態(tài)、腸道酶活性及盲腸發(fā)酵參數(shù)的影響，最終為家兔飼料的開發(fā)提供更有力的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計。按體重相近原

則，隨機將100只35日齡的新西蘭斷奶純種白兔分為5組，每組10個重復，每個重復2只兔。對照組(C組)和4個替代組(S25、S50、S75和S100組)分別飼喂5種不同比例(0、25%、50%、75%和100%)大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉的飼糧。試驗期15 d。對照組飼糧的消化能及粗蛋白質(zhì)、粗纖維的含量分別為11.28 MJ/kg、17.50%、17.14%，大黑山薏苡草粉的消化能及粗蛋白質(zhì)、粗纖維的含量分別為5.69 MJ/kg、13.46%、29.58%，苜蓿草粉的消化能及粗蛋白質(zhì)、粗纖維的含量分別為7.40 MJ/kg、15.30%、26.10%。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

續(xù)表1項目 Items組別 GroupsCS25S50S75S100總磷 TP0.59(0.49)0.59(0.53)0.59(0.55)0.59(0.53) 0.59(0.49)總賴氨酸 TLys0.890.890.890.890.89總蛋氨酸 TMet0.620.620.620.620.62

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kilogram of diets: Fe 30 mg，Cu 6 mg，Zn 35 mg，Mn 8 mg，Se 0.05 mg，Co 0.3 mg，I 0.4 mg，VA 6 000 IU，VD 900 IU，VE 15 IU，VK31 mg，生物素 biotin 100 μg，膽堿 choline 100 mg，吡哆醇 pyridoxine 0.5 mg，核黃素 riboflavin 3 mg，VB129 μg，煙酸 niacin 35 mg，泛酸 pantothenic acid 8 mg。

2)括號外為計算值，括號內(nèi)為實測值。The calculated and measured values lied outside and inside of parentheses, respectively.

1.2 樣品采集及指標測定

1.2.1 生長性能

以重復為單位，每日稱重并記錄給料量、余料量和浪費料量，試驗開始和結(jié)束時早晨喂料前稱重每只動物，計算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。

1.2.2 腸道形態(tài)

試驗第15天早晨空腹稱重試驗兔后，從各組不同重復選取4只接近平均體重的動物(未考慮性別)，參照Blasco等[20]方法進行屠宰。動物屠宰后，分離各腸段，生理鹽水輕輕沖洗內(nèi)容物并將各段取2～3 cm，置于4%的多聚甲醛溶液中保存，用于切片制作。各組樣品送于成都里來生物科技有限公司進行蘇木精-伊紅(HE)染色，測定十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)、絨毛高度/隱窩深度(V/C)以及盲腸CD。

1.2.3 腸道消化酶活性

考慮到大黑山薏苡草粉和飼糧中纖維和粗蛋白質(zhì)含量都較高，故選擇性地測定了腸道中胰蛋白酶、蔗糖酶、果膠酶和纖維素酶的活性。

動物屠宰后，取出小腸并分離各腸段，生理鹽水沖洗內(nèi)容物，縱向剖開，載玻片刮取黏膜，用于測定小腸各段中胰蛋白酶和蔗糖酶活性；同時收集盲腸內(nèi)容物于凍存管中，用于測定盲腸中果膠酶和纖維素酶活性。所有樣品暫存于液氮中。所有酶活性測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒，方法按相應試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.4 盲腸發(fā)酵參數(shù)

動物屠宰后，取出盲腸，立即用pH-3B型酸度計測定盲腸內(nèi)容物pH(選取3個不同位置)。盲腸內(nèi)容物樣品經(jīng)前處理后用瓦里安CP-3800型氣相色譜儀測定總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)含量[21]。氨態(tài)氮(NH3-N)含量采用比色法(波長700 nm)測定[22]。此外，同時收取C組和S100組動物的盲腸內(nèi)容物樣品，裝于滅菌后的凍存管中，樣品送于中國科學院成都生物公司采用16S rRNA的二代測序方法測定微生物在門水平及在屬水平上的組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2013初步整理數(shù)據(jù)，采用SAS 9.20進行單因子方差分析及Duncan氏法多重比較。P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔生長性能的影響

由表2可知，各組間ADFI、ADG和F/G均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔腸道形態(tài)的影響

由表3可知，各組的十二指腸、空腸、回腸的VH、CD和V/C及盲腸的CD均無顯著差異(P>0.05)，其中V/C整體趨勢以S50組較優(yōu)。

2.3 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔腸道消化酶活性的影響

由表4可知，除十二指腸中蔗糖酶活性外，其他各腸道各消化酶活性均無顯著差異(P>0.05)，均以S50組活性相對較高。其中，S50組十二指腸中蔗糖酶活性顯著高于S75和S100組(P<0.05)，與其他各組無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼喂含不同比例大黑山薏苡草粉飼糧生長肉兔的生長性能

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 飼喂含不同比例大黑山薏苡草粉飼糧生長肉兔的腸道形態(tài)

表4 飼喂含不同比例大黑山薏苡草粉飼糧生長肉兔的腸道消化酶活性

2.4 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔盲腸發(fā)酵參數(shù)及微生物組成的影響

由表5可知，各組的盲腸pH及NH3-N、TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量以及乙酸/(丙酸+丁酸)均無顯著差異(P>0.05)。其中，盲腸NH3-N含量以S50組較高。同時，C組和S100組之間的盲腸微生物在門水平及屬水平的組成均無明顯差異(圖1和圖2)。

表5 飼喂含不同比例大黑山薏苡草粉飼糧生長肉兔的盲腸發(fā)酵參數(shù)

圖中T表示對照組(C組)，Hm表示S100組。圖2同。

In the figure, T represents the control group (C group), and Hm represents the S100 group. The same as Fig.2.

圖1盲腸微生物門水平上的分布

Fig.1 Caecal microbial distribution at the phylum level

3 討 論

3.1 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔腸道形態(tài)的影響

小腸是家兔消化和吸收養(yǎng)分的主要場所，其絨毛的物理作用與隱窩的化學作用聯(lián)合發(fā)揮作用，促進養(yǎng)分的消化與吸收[23]。因此，小腸VH、CD和V/C可反映腸道的發(fā)育狀況與消化吸收養(yǎng)分的能力。研究表明，纖維的來源影響家兔腸道形態(tài)[24-25]。中草藥飼料添加劑中的有效成分(有機酸、黃酮類、生物堿等)可一定程度促進家兔腸道黏膜結(jié)構(gòu)完整，并改善腸道結(jié)構(gòu)[26]。本試驗結(jié)果顯示，替代組的小腸中VH和V/C在一定程度上有所增加，CD基本接近。可見大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉后，可一定程度促進家兔對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，且對動物的腸道發(fā)育無不利影響，這與薏苡仁在小鼠上的試驗結(jié)果[27]相似。這與前期報道的飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化率及動物生長性能的結(jié)果[19]相匹配。分析其原因可能是大黑山薏苡草粉中含有與薏苡仁中相似的抗性淀粉，對家兔的腸道組織形態(tài)有一定的改善作用，同時增加了有益菌的增殖，進而促進家兔的消化能力[9-11,14]。

圖2 盲腸微生物屬水平上的分布

3.2 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔腸道消化酶活性的影響

在動物消化代謝中，小腸黏膜中的消化酶發(fā)揮主要作用[28]。蔗糖酶來源于腸道脫落的腸上皮細胞，分解飼糧中的雙糖為單糖，進而被動物吸收利用[29]。胰蛋白酶主要由胰腺分泌，主要反映動物對飼糧中的粗蛋白質(zhì)的消化能力。維素酶和果膠酶主要由家兔盲腸中微生物產(chǎn)生，其活性受飼糧中纖維水平、來源的影響[30-32]。研究表明，中草藥成分可一定程度激活小腸中的蔗糖酶活性[33]。同時隨著動物的生長發(fā)育，二糖酶在成年期動物腸道中空腸中的蔗糖酶活性高于十二指腸和回腸[34]。本試驗中蔗糖酶的活性以空腸較高，十二指腸和回腸次之，這與Siddons[35]的研究結(jié)果一致，且與動物的生長發(fā)育一致。胰蛋白酶活性以回腸較高，其次為空腸，十二指腸最低。這說明蛋白質(zhì)的消化主要在小腸的后半段。此外，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，替代組小腸各段酶活性(十二指腸蔗糖酶活性除外)均不同程度高于對照組，且以S50組較高。可見大黑山薏苡草粉替代苜蓿草粉后對小腸各段的消化酶活性無負面影響，并在一定程度上提高了試驗兔腸道中的消化酶的活性。該結(jié)果與大黑山薏苡草粉對飼糧中的養(yǎng)分消化率結(jié)果[19]相符。這可能與大黑山薏苡草粉中的功能性物質(zhì)有一定的聯(lián)系[3,6]。

3.3 不同比例大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔盲腸發(fā)酵參數(shù)及微生物組成的影響

盲腸作為家兔最重要的消化器官之一，其內(nèi)環(huán)境影響微生物的生長與繁殖，進而影響家兔健康[32]。其中盲腸pH及氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸含量是評定家兔腸道健康的重要指標。其中，NH3-N是主要的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物，也是盲腸微生物合成菌體蛋白的重要底物[36]。此外，盲腸內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸中的短鏈脂肪酸在家兔的營養(yǎng)代謝及能量提供中發(fā)揮重要作用[37]。研究表明，盲腸pH增加會引起家兔腹瀉率增加[38]。本試驗中對照組盲腸pH略高于替代組，與前期試驗兔的發(fā)病率(主要特征為腹瀉)結(jié)果[19]相匹配，這可能是大黑山薏苡草粉中含有與薏苡仁中同樣的抗腹瀉的活性成分，間接影響了盲腸中的pH[3-4,6,10-11]。此外，本試驗中替代組盲腸NH3-N含量均大于對照組，分析原因可能是替代后，提高了試驗肉兔對蛋白質(zhì)的利用，增加盲腸中的分解產(chǎn)物，進而增加了NH3-N的含量。分析原因，可能與本試驗中動物對飼糧中的粗蛋白質(zhì)消化率有關[21]。另外，Gidenne等[32]研究表明，飼糧中的纖維水平與揮發(fā)性脂肪酸的含量呈正相關，且提高乙酸比例，降低丁酸比例。并且飼糧中纖維的木質(zhì)化程度對揮發(fā)性脂肪酸有負面影響[39]。本試驗中，替代組的揮發(fā)性脂肪酸含量不同程度地高于對照組。這可能與大黑山薏苡草粉中的纖維組分的組成及類型有一定的關系，該結(jié)果與去殼薏苡在小鼠上的研究結(jié)果[11,16]相似。同時，微生物的變化，可改變盲腸內(nèi)環(huán)境，從C組與S100組的盲腸微生物對比結(jié)果，可以進一步支撐盲腸參數(shù)的結(jié)果，證明大黑山薏苡草粉可以完全替代苜蓿草粉。

4 結(jié) 論

綜上所述，大黑山薏苡草粉替代飼糧中苜蓿草粉對生長肉兔的腸道形態(tài)、腸道酶活性及盲腸發(fā)酵參數(shù)和微生物組成均無不利影響。本試驗結(jié)果更進一步證明，大黑山薏苡草粉可以替代苜蓿草粉用于商品肉兔飼糧，建議替代比例為50%。