黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨免疫性能、抗氧化性能以及腸道形態(tài)的影響

趙文文 袁文華 沈軍達(dá) 袁慧坤 王 源 李國(guó)勤,3 盧立志,3* 刁新平*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310000；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310021)

抗生素和防病促生長(zhǎng)的化學(xué)藥物作為飼料添加劑在畜禽生產(chǎn)中得到了廣泛的使用，雖然抗生素的使用可以增強(qiáng)畜禽的生長(zhǎng)能力,對(duì)畜禽的疫病方面的防控和治療都起到了一定的促進(jìn)作用，但是抗生素的大量使用會(huì)造成畜禽體內(nèi)細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)、畜產(chǎn)品中抗生素的殘余量增大,從而破壞腸道內(nèi)的微生物平衡[1-2]，另外還會(huì)造成耐藥菌的擴(kuò)散、超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生等[3]，這些都直接或間接危害到了人類的健康。黃芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)是中藥黃芪的主要成分之一，柳志余[4]研究表明，黃芪多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。Chen等[5]研究證實(shí)，黃芪多糖不僅能提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫力。肖婭楠[6]試驗(yàn)表明，飼糧中添加黃芪多糖可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，提高免疫器官指數(shù)。微生態(tài)制劑是一種能調(diào)整并維持畜禽腸道菌群平衡的、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育增強(qiáng)機(jī)體免疫力的、新型的綠色無(wú)公害添加劑[7]。有研究表明，適當(dāng)濃度的黃芪提取液對(duì)益生菌能起到一定的促生長(zhǎng)作用[8]。岑路等[9]研究表明，益生菌和黃芪多糖有很明顯的協(xié)同作用。本試驗(yàn)在飼糧中添加黃芪多糖、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)及其復(fù)合劑，旨在探討其單獨(dú)添加與復(fù)合添加對(duì)蛋雛鴨免疫性能、抗氧化性能和腸道形態(tài)的影響，為其在蛋鴨養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃芪多糖和桿菌肽鋅(Bacitracinzinc)由西安澤邦生物科技有限公司提供(黃芪多糖純度為60%，桿菌肽鋅純度為10%)，丁酸梭菌由湖北綠雪生物科技有限公司提供(活菌數(shù)量≥2×108CFU/g)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)選取1日齡、健康、體重相近的蛋雛公鴨600只，隨機(jī)分成5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只鴨。蛋鴨基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1998)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和臺(tái)灣畜牧學(xué)會(huì)(1993)標(biāo)準(zhǔn)中產(chǎn)蛋鴨需要量配制?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧；Ⅱ組(抗生素組)在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加40 mg/kg的桿菌肽鋅，Ⅲ組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加800 mg/kg的黃芪多糖，Ⅳ組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加250 mg/kg的丁酸梭菌，Ⅴ組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加800 mg/kg的黃芪多糖+250 mg/kg的丁酸梭菌。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在浙江省紹興市王府井鎮(zhèn)國(guó)偉禽業(yè)有限公司養(yǎng)殖基地進(jìn)行，飼養(yǎng)期為28 d。試驗(yàn)鴨在網(wǎng)上散養(yǎng)，自由采食和飲水，第1周飲用溫開(kāi)水，第2周開(kāi)始飲用室溫下放置4～5 h的冷水，一定要保證水的充足和清潔。試驗(yàn)期內(nèi)的光照制度為自然光照與人工光照相結(jié)合，育雛期第1周光照時(shí)間為24 h；第2～3周的光照時(shí)間逐漸過(guò)渡到16 h；從第4周開(kāi)始為自然光照。使用自動(dòng)控溫儀設(shè)備控制舍內(nèi)的溫度。保證每天洗刷水槽、料槽和類板1次，搞好鴨舍環(huán)境衛(wèi)生，避免驚嚇和干擾，每日仔細(xì)觀察試驗(yàn)鴨的精神狀況，觀察釆食飲水和類便是否有異常、是否有病死鴨等。按常規(guī)方法和程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。

1.4 樣品的采集和處理

在試驗(yàn)第28天從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取接近平均體重的蛋雛鴨2只進(jìn)行稱重并記錄，然后進(jìn)行頸靜脈采血，3 500 r/min離心15 min分離血清分裝于EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２裳髮Ⅷ喨糠叛幩?，摘取肝臟(不包括膽囊)封袋，-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆?；摘取免疫器?脾臟、胸腺、法氏囊)，去除結(jié)締組織和脂肪，用電子分析天平稱重并記錄；取十二指腸、空腸、回腸中央位置組織各2 cm左右，在生理鹽水內(nèi)清洗后置于中性緩沖福爾馬林(pH 7.4)溶液中固定，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。試驗(yàn)所需所有工具都經(jīng)高壓滅菌處理，并用75%酒精擦拭桌面以去除環(huán)境樣品微生物污染。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)微量元素預(yù)混料和維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 The microelement premix and vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 4 000 IU，VB13.5mg，VB25.5 mg，吡哆醇 pyridoxol 2.5 mg，VB120.01 mg，VD31 500 IU，VK22 mg，生物素 biotin 0.10 mg，葉酸 folic acid 1.0 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 10 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg，Cu 10 mg，F(xiàn)e 80 mg，Mn 60 mg，Zn 60 mg，I 0.40 mg，Se 0.20 mg。

2)代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。ME was a calculated value, while the others were measured values.

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 血清免疫指標(biāo)

用比色法測(cè)定血清中的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和補(bǔ)體3(C3)、補(bǔ)體4(C4)含量，采用A6半自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定，試劑盒由北京華英生物技術(shù)有限公司提供。

1.5.2 免疫器官指數(shù)

免疫器官(胸腺、脾臟、法氏囊)指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮重/宰前空腹活重。

1.5.3 血清和肝臟的抗氧化指標(biāo)

參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清和肝臟中的總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性，采用A6半自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定，試劑盒由北京華英生物技術(shù)有限公司提供。

1.5.4 腸道形態(tài)

將固定好的十二指腸、空腸、回腸各段組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、展片、粘片及HE染色，封固后每組內(nèi)每張切片挑選40倍視野進(jìn)行拍照，測(cè)定絨毛高度(VH)、隱窩深度(CD)，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007進(jìn)行初步的處理，用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響

如表2所示，Ⅲ組、Ⅴ組的血清IgA含量與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間差異顯著(P<0.05)，Ⅲ組和Ⅴ組的血清IgA含量相對(duì)于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組分別提高了9.55%、7.92%、6.86%和13.07%、11.39%、10.29%；Ⅴ組的血清IgM含量相對(duì)于Ⅱ組提高了32.14%(P<0.05)；Ⅴ組的血清IgG、C3和C4的含量都高于其他各組，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨免疫器官指數(shù)的影響

如表3所示，Ⅴ組的胸腺指數(shù)相較于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別提高了45.32%、27.59%、25.59%、22.70%(P<0.05)，Ⅳ組相較于Ⅰ組也提高了18.43%(P<0.05)，而Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅲ組之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅳ組、Ⅴ組的脾臟指數(shù)相較于Ⅰ組、Ⅱ組分別提高了20.41%、19.19%和11.22%和10.10%(P<0.05)；Ⅴ組的法氏囊指數(shù)明顯高于其他各組，但差異不顯著(P>0.05)。

2.3 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表4所示,在第28天，血清抗氧化指標(biāo)方面，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組的T-AOC分別較Ⅰ組提高了50.17%、47.67%、90.03%(P<0.05)，Ⅴ組較Ⅱ組提高了68.48%(P<0.05)；Ⅳ組的MDA含量較Ⅰ組降低了43.71%(P<0.05)；Ⅴ組的GSH-Px活性相較于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別提高了80.53%、60.08%、25.97%、29.70%(P<0.05)；Ⅴ組的T-SOD活性分別較Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別提高了67.48%、63.14%、21.69%、26.48%(P<0.05)。

表3 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨免疫器官指數(shù)的影響

肝臟抗氧化指標(biāo)方面：Ⅴ組T-AOC相較于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別提高了90.00%(P<0.05)、68.89%(P<0.05)、26.67%(P>0.05)、27.73%(P>0.05)；而Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組之間的差異不顯著(P>0.05)；Ⅳ組MDA含量相對(duì)于Ⅰ組下降了43.66%(P<0.05)，而Ⅱ組、Ⅳ組、Ⅴ組之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組GSH-Px活性相較于Ⅰ組、Ⅱ組分別提高了54.48%、51.69%、59.62%和46.72%、44.07%、51.60%(P<0.05)，而Ⅳ組與Ⅲ組和Ⅴ組之間、Ⅱ組與Ⅰ組之間差異不顯著(P>0.05)；Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組T-SOD活性相較于Ⅰ組、Ⅱ組分別提高了74.34%、89.95%、90.26%和45.17%、58.17%、58.43%(P<0.05)，而Ⅲ組與Ⅳ組與Ⅴ組之間、Ⅱ組與Ⅰ組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨腸道形態(tài)的影響

如表5所示，Ⅰ組十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度與其他各組之間差異不顯著(P>0.05)。Ⅴ組十二指腸的隱窩深度相較于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組分別降低了11.04%、10.48%、9.96%(P<0.05)；Ⅳ組、Ⅴ組空腸的隱窩深度相較于Ⅰ組分別降低了21.10%、28.06%(P<0.05)；Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組回腸的隱窩深度相較Ⅰ組、Ⅱ組分別降低了48.29%、14.56%、47.68%和31.84%、34.37%、33.60%(P<0.05)，Ⅲ組、Ⅳ組、Ⅴ組之間差異不顯著(P>0.05)。各組之間十二指腸的絨毛高度/隱窩深度值差異不顯著(P>0.05)，Ⅴ組空腸的絨毛高度/隱窩深度值相較Ⅰ組、Ⅱ組分別提高了44.31%和40.00%(P<0.05)，Ⅴ組、Ⅳ組、Ⅲ組與Ⅰ組、Ⅱ組之間回腸的絨毛高度/隱窩深度值差異顯著(P<0.05)。

表4 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表5 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨腸道形態(tài)的影響

3 討 論

3.1 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清免疫指標(biāo)的影響

畜禽的免疫功能主要是通過(guò)免疫因子(免疫球蛋白、細(xì)胞因子、補(bǔ)體)來(lái)識(shí)別和排除抗原性異物，從而保護(hù)機(jī)體內(nèi)外的生理平衡。IgA、IgG、IgM是家禽體內(nèi)重要的3種免疫球蛋白，而免疫球蛋白的含量也是衡量動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能的重要指標(biāo)[10]，血清中C3、C4的含量變化是評(píng)估免疫功能好壞、疾病變化和治療效果的重要指標(biāo)。Lin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟；王海鳳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加適宜濃度的黃芪多糖可以提高機(jī)體IgA、IgG、IgM的含量，從而增強(qiáng)了畜禽的免疫力；Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠提高肉雞血清IgA、IgG、IgM的含量；鄭有秀等[14]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加丁酸梭菌可以提高斷奶仔豬的血清IgA、IgG含量；鄒知明等[15]研究表明，黃芪多糖和益生菌互作可以顯著促進(jìn)腸道IgA的分泌；黃克宏等[16]研究表明，蘇氨酸與黃芪多糖、益生菌在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面具有顯著的協(xié)同效應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)第28天，Ⅴ組(復(fù)合劑組)的血清IgA含量顯著高于其他各組，血清IgM、IgG、C3、C4含量與其他各組雖差異不顯著，但均有明顯提高的趨勢(shì)，這是因?yàn)槎∷崴缶忘S芪多糖的互作更好地促進(jìn)了腸道對(duì)黃芪多糖的吸收，使其免疫指標(biāo)的含量在一定程度上升高，共同提高了機(jī)體的免疫性能。

3.2 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨免疫器官指數(shù)的影響

動(dòng)物自身免疫細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分裂增殖可導(dǎo)致免疫器官的重量增加，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫功能。王虹玲等[17]在試驗(yàn)中用免疫器官指數(shù)作為雛雞免疫功能強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。免疫器官指數(shù)可以反映出機(jī)體的免疫性能的高低[18]。許多研究表明，黃芪多糖可以促進(jìn)機(jī)體免疫器官發(fā)育，顯著提高免疫器官指數(shù)[19-20]；賈志新[21]研究表明，飼糧中添加不同水平的丁酸梭菌可顯著提高21日齡肉鴨的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；呂鑫[22]研究表明，益生菌和黃芪多糖的互作可以提高海蘭褐蛋雞的免疫器官指數(shù)；趙云煥等[23]研究表明，益生菌和黃芪多糖的互作可以顯著提高固始雞的免疫器官指數(shù)；鄒知明等[15]研究表明，黃芪多糖和益生菌的互作可以維持腸道健康，不僅能顯著抑制腸道大腸桿菌的數(shù)量，還能增加乳酸桿菌的數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)第28天，Ⅴ組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組，而法氏囊指數(shù)與其余各組差異并不顯著，但Ⅴ組的法氏囊指數(shù)也均高于其他各組，這說(shuō)明飼糧中添加黃芪多糖-丁酸梭菌復(fù)合劑對(duì)免疫器官的生長(zhǎng)起到促進(jìn)的作用，這也許是黃芪多糖進(jìn)入動(dòng)物腸道內(nèi)調(diào)節(jié)了微生物生存的環(huán)境，與丁酸梭菌互作使得有益菌大量繁殖，有害菌的數(shù)量大幅度降低，進(jìn)而使得有益菌的代謝物在腸道內(nèi)產(chǎn)生氨基酸、有機(jī)酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]，進(jìn)而促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)，試驗(yàn)說(shuō)明了黃芪多糖-丁酸梭菌復(fù)合劑能有效促進(jìn)蛋雛鴨免疫器官的生長(zhǎng)。

3.3 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

GSH-Px在畜禽內(nèi)的主要作用是減輕有機(jī)氨過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體的損害、消除脂類氨過(guò)氧化物以及同超氧化物歧化酶(SOD)一起共同保護(hù)機(jī)體細(xì)胞的健康[25-26]。畜禽體內(nèi)的MDA含量越高，說(shuō)明過(guò)氧化反應(yīng)越強(qiáng)烈，也反映出了機(jī)體細(xì)胞受損傷程度越大。孫波等[27]和陶浩[28]都研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有增強(qiáng)免疫和抗氧化的功能。左兆云等[29]研究表明，在蛋雞飼糧中添加100～300 mg/kg黃芪多糖可以使蛋黃中SOD活性升高，MDA含量降低。鄭嫩珠等[30]研究表明，飼糧中添加黃芪多糖可以使機(jī)體內(nèi)SOD、GSH-Px活性和T-AOC升高，MDA含量降低。賈志新[21]研究表明，飼糧中添加丁酸梭菌可以不同程度提高櫻桃谷肉鴨血清中抗氧化指標(biāo)，提高機(jī)體的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在試驗(yàn)第28天，試驗(yàn)組血清和肝臟中的T-AOC及T-SOD、GSH-Px活性均高于對(duì)照組和抗生素組，且Ⅴ組均最高，說(shuō)明黃芪多糖和丁酸梭菌復(fù)合添加較單一添加更能提高機(jī)體的抗氧化能力；試驗(yàn)組血清和肝臟中的MDA含量均低于對(duì)照組和抗生素組，且添加丁酸梭菌組降低MDA含量的能力較強(qiáng)，也許是丁酸梭菌在腸道內(nèi)定值，破壞了機(jī)體內(nèi)的氧化反應(yīng)所需要的物質(zhì)，使得機(jī)體的抗氧化能力增強(qiáng)。

3.4 黃芪多糖和丁酸梭菌對(duì)蛋雛鴨腸道形態(tài)的影響

小腸是畜禽吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，腸絨毛的高度變高和隱窩深度變淺都會(huì)増加機(jī)體腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，從而提升動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。而小腸絨毛高度/隱窩深度值也可以用來(lái)反映小腸的吸收功能，其比值越高，表示腸絨毛對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收越強(qiáng)。陶浩[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加黃芪多糖可以提高肉仔雞十二指腸的絨毛高度，降低隱窩深度；趙熙等[31]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌活菌制劑可以促進(jìn)腸道有益菌增殖，抑制有害菌增殖；鄒知明等[15]研究表明，黃芪多糖和益生菌互作可以有效增加腸絨毛的長(zhǎng)度和寬度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖和丁酸梭菌復(fù)合添加相較于單獨(dú)添加能更有效地降低蛋雛鴨十二指腸、空腸和回腸的隱窩深度，提高了空腸和回腸的絨毛高度/隱窩深度值，也在一定程度上提高了十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度以及十二指腸的絨毛高度/隱窩深度值，這可能是黃芪多糖和丁酸梭菌互作使腸道內(nèi)的有益菌數(shù)量增多，有害菌數(shù)量減少，而丁酸梭菌的主要代謝產(chǎn)物又是丁酸，對(duì)腸道上皮細(xì)胞的組織和再生起著很大的作用，所以兩者互作改善了腸道的形態(tài)。

4 結(jié) 論

飼糧中添加黃芪多糖和丁酸梭菌復(fù)合劑可以提高蛋雛鴨的免疫性能和抗氧化性能，并且可以改善腸道的形態(tài)，黃芪多糖和丁酸梭菌復(fù)合劑組效果優(yōu)于單一制劑組、抗生素組和對(duì)照組。