圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加殼寡糖對母豬、仔豬免疫功能及母豬腸道微生物的影響

柒啟恩 肖俊峰 張 軍 趙 海 劉 霜 溫慶琪

(1.福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司，福建省生豬營養(yǎng)與飼料重點實驗室，漳州363000；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山528231；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌330045)

圍產(chǎn)期是母豬繁殖周期中一段相當(dāng)特殊而且關(guān)鍵的時期，其特點表現(xiàn)在2個方面：一是母豬在分娩過程中和產(chǎn)后一段時間內(nèi)，體力消耗過大、產(chǎn)生劇烈疼痛；二是母豬分娩前后皮質(zhì)醇和雌激素水平的劇烈波動，淋巴細(xì)胞和活躍單核細(xì)胞數(shù)量減少，對機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了較大影響，導(dǎo)致其抵抗力下降[1-5]。同時，圍產(chǎn)期也是造成仔豬死亡的主要時期，由于各組織、器官及免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，機(jī)體適應(yīng)性差，大部分?jǐn)嗄糖白胸i在產(chǎn)后前3 d內(nèi)死亡。初生重、出生順序、初乳的攝入時間、產(chǎn)后1 h內(nèi)的體溫下降是造成新生仔豬死亡的主要因素[6]。新生仔豬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育，需要通過吸收初乳中的免疫球蛋白G(IgG)來獲得被動免疫[7]。母乳是哺乳仔豬生存和生長發(fā)育的決定性因素，直接影響仔豬生存、生長、發(fā)育和機(jī)體的組成[8]。初乳是母豬在懷孕最后階段和產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)分泌的乳汁。它所富含的天然生長因子對于大腦、心臟、胰腺、肝臟、腎臟和未成熟的腸道正常發(fā)育至關(guān)重要；它所富含的免疫球蛋白在分娩后數(shù)小時內(nèi)可以被仔豬空腸和回腸完整的吸收，為哺乳仔豬構(gòu)建被動免疫[9-10]。生產(chǎn)數(shù)小時之后，母乳組成發(fā)生顯著變化，初乳轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｈ?。在這個過程中，乳中固形物和蛋白質(zhì)的含量降低，乳糖和脂肪含量增加，同時免疫球蛋白的含量也顯著降低。因而，常乳的主要作用是提供營養(yǎng)，其次是提供免疫保護(hù)[9-10]。圍產(chǎn)期母豬的營養(yǎng)對仔豬的健康有重要影響，增強(qiáng)母豬的免疫力，提高母乳質(zhì)量，是減少哺乳仔豬死亡、維護(hù)哺乳仔豬健康狀況、改善哺乳仔豬生產(chǎn)性能以及提高母豬繁殖效率的重要途徑之一[11]。

殼寡糖(COS)是氨基葡萄糖的天然堿性聚合物，由殼聚糖通過化學(xué)和酶水解得到[12]。COS易吸收，功效是殼聚糖的數(shù)十倍，飼糧中添加COS能促進(jìn)動物生長、提高免疫力等，對動物具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗癌等多種生理功能[13]。COS已被證實可以提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，這可能與它的增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群和改善腸道形態(tài)功能有關(guān)[14-18]。

目前關(guān)于COS的研究主要集中在斷奶仔豬中，對圍產(chǎn)期母豬免疫功能的研究未見報道。本研究的目的旨在探討COS能否調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期母豬的免疫狀態(tài)，進(jìn)一步提高哺乳仔豬的免疫力，從而提高哺乳仔豬成活率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

COS為水溶性COS[寡聚β-(1-4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖]，聚合度在2～10之間，純度為10%，由大連中科格萊克生物科技有限公司提供。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

選取胎次(第3、4胎)、體重[(300±15) kg]接近的妊娠90 d大約克母豬40頭，隨機(jī)分為2組，每組20個重復(fù)，每個重復(fù)1頭?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參照NRC(2012)[19]設(shè)計，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加30 mg/kg COS(按10%純度COS折算成純品的添加量)的試驗飼糧。

試驗期間，每天07:30、15:00飼喂母豬，懷孕90 d至產(chǎn)前第1～2天每頭母豬飼喂3.0 kg/d。母豬產(chǎn)前第3天轉(zhuǎn)入產(chǎn)房，母豬生活區(qū)和仔豬活動區(qū)均為漏縫地板，欄內(nèi)設(shè)仔豬保溫箱。產(chǎn)前第1～2天飼喂2.0 kg/d，產(chǎn)仔當(dāng)天不飼喂，產(chǎn)后第1天飼喂1.0 kg/d，第2天飼喂2.0 kg/d，第3天飼喂3.0 kg/d，第4～7天飼喂4.0 kg/d，自由飲水。試驗從母豬妊娠第90天開始至分娩后第7天結(jié)束，在福建省漳州傲農(nóng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司進(jìn)行。嚴(yán)格按照豬場防疫和飼養(yǎng)管理制度進(jìn)行操作。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼糧提供Mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 150 mg，Cu (as copper sulfate) 20 mg，Zn (as zinc sulfate) 150 mg，Mn (as manganese sulfate) 30 mg，Se (as sodium selenite) 0.4 mg，I (as potassium iodide) 0.3 mg。

2)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供Vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 17 800 IU，VD35 000 IU，VE 44 IU，VK 5 mg，VB18 mg，VB215 mg，VB68.5 mg，VB120.05 mg，煙酰胺 nicotinamide 60 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 25 mg，葉酸 folic acid 2.5 mg。

3)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 樣品采集

1.3.1 母豬生產(chǎn)性能指標(biāo)采集

母豬分娩時，記錄每頭仔豬的出生時間、初生個體重(kg)。

1.3.2 母豬初乳采集

母豬分娩后2 h，分別從前、中、后3個乳區(qū)的乳頭采集混合乳樣，每頭母豬采集初乳15 mL于滅菌的EP管中，-20 ℃保存待測。檢測前經(jīng)過12 000 r/min離心10 min去除乳脂。

1.3.3 仔豬、母豬血液采集

分娩當(dāng)天，采集每頭母豬所產(chǎn)9頭仔豬的臍帶血[20]，以初生時間相近的3頭仔豬臍帶血進(jìn)行等體積混合作為1個樣本，共采集3個樣本(每頭3 mL，每個樣本9 mL)；分娩后第8天09:00對空腹的試驗?zāi)肛i經(jīng)前腔靜脈采血10 mL。將所采集的血液樣品于4 ℃靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，收集上清液即血清，將所收集血清分裝在1.5 mL離心管中，-20 ℃保存待測。

1.3.4 母豬糞便采集

母豬分娩后第8天07:00—09:00收集新鮮母豬糞便，分裝在無菌封口袋中，-20 ℃保存待測。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 母豬繁殖性能指標(biāo)測定

母豬的產(chǎn)程(第1頭仔豬產(chǎn)出到胎衣排出的時間間隔)、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重(每頭活仔初生個體重之和)和仔豬平均初生重(仔豬初生窩重/產(chǎn)活仔數(shù))由母豬分娩時所記錄每頭仔豬的出生時間、初生個體重計算得出。

1.4.2 母豬血清、初乳以及仔豬血清免疫功能相關(guān)指標(biāo)測定

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測母豬血清及初乳、仔豬血清中IgG、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作按說明書進(jìn)行。

1.4.3 母豬糞便pH測定

取5 g新鮮糞樣用45 mL無菌生理鹽水稀釋后，用酸度計測定其pH。

1.4.4 母豬糞便微生物計數(shù)

糞樣稀釋：于超凈臺內(nèi)取約4 g糞樣于無菌錐形瓶中，加入相應(yīng)量的無菌生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋，用磁力振蕩器振蕩10 min至混合均勻，得到10-1倍稀釋液，再取0.5 mL待測10-1倍稀釋液加入裝有4.5 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩混勻，得到10-2倍稀釋液，重復(fù)以上操作將菌液分別稀釋至10-3、10-4和10-5倍。

接種及培養(yǎng)：乳酸菌(Lactobacillus)計數(shù)時取糞樣稀釋液中10-2～10-4倍稀釋液0.01 mL接種于MRS培養(yǎng)基平皿上，每個稀釋濃度做2個重復(fù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計數(shù)；大腸桿菌(Escherichiacoli)計數(shù)時取糞樣稀釋液中10-3～10-5倍稀釋液0.01 mL接種于麥康凱培養(yǎng)基平皿上，每個稀釋濃度做2個重復(fù)，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)；沙門氏菌(Salmonella)計數(shù)時取糞樣稀釋液中10-3～10-5倍稀釋液0.01 mL接種于SS瓊脂培養(yǎng)基平皿上，每個稀釋濃度做2個重復(fù)，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.4.5 母豬糞便乙酸和丙酸含量測定

樣品的制備：稱取大約10 g的糞便樣品，放入1個100 mL燒杯中，加入40 mL水和2 mL 50%氫氧化鈉溶液。將上述溶液在蒸氣浴上加熱10 min，冷卻后采用1∶1硫酸將溶液的pH調(diào)整到2。將上述溶液移入100 mL容量瓶中，采用Milli-Q超純水稀釋到刻度。采用Spartan 30/A 0.2 μm一次性過濾器將溶液進(jìn)行過濾，將過濾液收集在螺旋蓋樣品瓶里。進(jìn)樣10 μL，通過Agilent 1260 Infinity液相色譜儀檢測乙酸和丙酸含量。

標(biāo)準(zhǔn)物的制備：稱取0.05 g乙酸和0.05 g丙酸，精確到0.01 g，放入1個100 mL燒杯中，加入40 mL水和2 mL 50%氫氧化鈉溶液。將溶液在蒸氣浴上加熱10 min，冷卻后采用1∶1硫酸將溶液的pH調(diào)整到2。將上述溶液移入100 mL容量瓶中，采用Milli-Q超純水稀釋到刻度。采用Spartan 30/A 0.2 μm一次性過濾器將溶液進(jìn)行過濾，將過濾液收集在螺旋蓋樣品瓶里。進(jìn)樣10 μL，通過Agilent 1260 Infinity液相色譜儀檢測乙酸和丙酸含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的t檢驗進(jìn)行組間差異顯著性比較，以P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬繁殖性能的影響

由表2可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬產(chǎn)程、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重、仔豬平均初生重均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，圍產(chǎn)期飼糧中添加COS母豬產(chǎn)程增加5.9%，總產(chǎn)仔數(shù)提高4.7%，產(chǎn)活仔數(shù)提高2.7%，仔豬初生窩重提高3.3%，仔豬平均初生重?zé)o變化。

表2 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬繁殖性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS顯著提高了母豬血清中IgG、IgA和IL-6含量(P<0.05)，對血清中IgM、IL-2和TNF-α含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬血清免疫指標(biāo)的影響

2.3 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬初乳免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS顯著提高了母豬初乳中IgG、IL-2和IL-6含量(P<0.05)，對初乳中IgA、IgM和TNF-α含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬初乳免疫指標(biāo)的影響

2.4 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對初生仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS顯著提高了初生仔豬血清中IL-2和IL-6含量(P<0.05)，顯著降低了血清中IgA含量(P<0.05)，對血清中IgG、IgM和TNF-α含量無顯著影響(P>0.05)。

表5 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對初生仔豬血清免疫指標(biāo)的影響

2.5 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬糞便pH及微生物數(shù)量的影響

由表6可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS顯著降低了母豬糞便沙門氏菌數(shù)量(P<0.05)，并有降低糞便大腸桿菌數(shù)量的趨勢(P=0.062)，對糞便pH及乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。

表6 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬糞便pH及微生物數(shù)量的影響

2.6 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬糞便乙酸和丙酸含量的影響

由表7可知，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬糞便乙酸和丙酸含量無顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期(妊娠第90天開始至產(chǎn)后第7天結(jié)束)母豬飼糧中添加30 mg/kg COS對母豬產(chǎn)程、總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重、仔豬平均初生重均無顯著影響。龍次民等[21]研究結(jié)果顯示，妊娠后期(妊娠第85天開始至產(chǎn)仔結(jié)束)母豬飼糧中添加30 mg/kg COS對母豬繁殖性能無顯著影響，但是在一定程度上可以縮短母豬產(chǎn)程。但Cheng等[22]的研究顯示，繁殖期(配種后開始至產(chǎn)后21 d斷奶結(jié)束)母豬飼糧中添加40 mg/kg COS顯著改善了母豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重和仔豬平均初生重。對于母豬繁殖性能，上述3個研究得到了不同的結(jié)果。本研究的飼喂過程及結(jié)果與龍次民等[21]的研究結(jié)果相近，而與Cheng等[22]的研究結(jié)果有一定的差異，這可能與飼喂期有關(guān)。據(jù)報道，妊娠母豬40%的胚胎死亡發(fā)生于妊娠第20天前[23]，這是決定窩產(chǎn)仔數(shù)最重要的原因。龍次民等[21]及本試驗的研究從母豬妊娠后期(妊娠第85～90天)開始飼喂COS，而Cheng等[22]的研究從母豬配種后開始飼喂COS。因此，妊娠前期飼喂COS具有提高母豬繁殖性能的功能，而僅在妊娠后期飼喂則無顯著效果。COS對母豬繁殖性能的影響可能與免疫增強(qiáng)有關(guān)。

表7 圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加COS對母豬糞便乙酸和丙酸含量的影響

母豬分娩受復(fù)雜的生理和內(nèi)分泌活動控制，是一個極度疲勞、劇烈疼痛和各種代謝紊亂的過程[23]。在圍產(chǎn)期，大多數(shù)動物的發(fā)病率都有所增加，這很可能是機(jī)體對病原體的敏感性增加，從而使免疫力下降所致。研究已證實，分娩前后皮質(zhì)醇和雌激素的水平發(fā)生劇烈的波動，對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。分娩時后備母豬血液中單核細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)生免疫球蛋白的單核細(xì)胞數(shù)量顯著下降，免疫球蛋白含量與皮質(zhì)醇水平呈現(xiàn)出高度的相關(guān)性[4,24]。因此，圍產(chǎn)期母豬的免疫力顯著降低。研究表明，寡糖可調(diào)節(jié)血液中免疫球蛋白含量[25]。Huang等[26]研究了COS對肉雞的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加100 mg/kg COS促進(jìn)了肉雞免疫器官的發(fā)育，同時顯著提高了肉雞血液中免疫球蛋白含量，說明COS對提高肉雞的免疫力有一定的作用。黨國旗等[27]研究了COS對斷奶仔豬的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加50 mg/kg COS顯著提高了斷奶仔豬血液中IgG、IgA、IgM和TNF-α的含量，IL-6的含量有所降低。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，COS通過激活巨噬細(xì)胞的Toll樣受體-4(TLR4)表現(xiàn)出強(qiáng)有力的免疫激活性能[28]。本試驗結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加30 mg/kg COS顯著提高了母豬血清中IL-6含量。結(jié)果表明，COS激活了母豬體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，使得細(xì)胞因子分泌增加。巨噬細(xì)胞可以通過輔助細(xì)胞激活B細(xì)胞，產(chǎn)生響應(yīng)[29]。本試驗結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加30 mg/kg COS顯著提高了母豬血清中IgG和IgA含量，這可能是COS通過巨噬細(xì)胞進(jìn)而激活了B細(xì)胞的結(jié)果。

Brambell[30]的報告指出,新生牛、山羊、綿羊、馬、驢和豬體內(nèi)的母源抗體水平很低甚至沒有，它們主要通過吸吮產(chǎn)后幾個小時內(nèi)的初乳獲得母源抗體。本試驗中，各項免疫指標(biāo)的含量在母豬血清中最高，其次是初乳中，在仔豬臍帶血中最低，約為母豬血清中含量的1/5。母豬和仔豬之間的免疫球蛋白很少通過胎盤傳遞，而只能在泌乳啟動期大量通過乳腺屏障進(jìn)入初乳中傳遞。本試驗中，飼糧中添加30 mg/kg COS改善了母豬血清中各項免疫指標(biāo)；初乳中也得到了相同的結(jié)果(初乳中IgM和TNF-α含量略有下降，但差異不顯著)，與母豬血清中的變化趨勢相一致；仔豬臍帶血中IL-2、IL-6和TNF-α含量與母豬血清及初乳中變化趨勢一致，然而IgG、IgA和IgM含量均有下降。母豬血清、母豬初乳和仔豬臍帶血中免疫球蛋白含量對COS的不同響應(yīng)再次說明了母豬和仔豬之間的免疫球蛋白主要通過初乳傳遞，而且COS對母豬免疫力的提高也可以通過初乳傳遞。

Kong等[31]在斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg COS顯著增加了回腸和結(jié)腸中乳酸菌的數(shù)量，同時降低了結(jié)腸中大腸桿菌的數(shù)量。Yang等[15]在斷奶仔豬飼糧中添加200～600 mg/kg COS顯著增加了試驗后第7天盲腸中乳酸菌的數(shù)量，同時降低了大腸桿菌的數(shù)量。本試驗結(jié)果顯示，圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加30 mg/kg COS顯著降低了母豬糞便沙門氏菌數(shù)量，有降低大腸桿菌數(shù)量的趨勢，對糞便pH及乳酸桿菌數(shù)量無顯著影響。本研究結(jié)果與前人結(jié)果的差異可能與COS添加量及試驗動物有關(guān)。整體來看，COS具有改善動物腸道菌群的效果。

4 結(jié) 論

圍產(chǎn)期(妊娠第90天至分娩后第7天)母豬飼糧中添加COS能改善母豬腸道健康，一定程度上提高產(chǎn)活仔數(shù)，顯著增強(qiáng)母豬及初生仔豬的免疫功能。