酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)、抗氧化能力和膽固醇代謝的影響

楊 玉 孫 煜 孫寶盛 盧營杰 李建慧 張俊珍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷030801)

硒是人和動(dòng)物必需的微量元素，缺硒可導(dǎo)致白肌病、克山病、肝硬化、癌癥、白內(nèi)障、心血管與抑郁癥等疾病發(fā)生。目前，世界上有40多個(gè)國家處于低硒或缺硒狀態(tài)，我國也是嚴(yán)重的缺硒國家之一。由于富硒雞蛋所含硒為有機(jī)態(tài)硒，容易被人體吸收利用，在發(fā)達(dá)國家已利用富硒酵母作為有機(jī)硒源，生產(chǎn)富硒雞蛋上市。而苜草素兼有抗氧化和免疫增強(qiáng)的雙重功效，推測(cè)苜草素應(yīng)該在生長周期長或有嚴(yán)重疾病隱患的情況下應(yīng)用效果更為理想。王寶維等[1]報(bào)道，在鵝飼糧中添加不同硒源均顯著提高了血清與肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)，顯著降低了血清與肝臟中丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量，且酵母硒比亞硒酸鈉和納米硒的抗氧化作用更為顯著。硒源和水平對(duì)蛋雞血液硒含量、GSH-Px活性和T-AOC有顯著影響，有機(jī)硒較無機(jī)硒更易于沉積在雞蛋、肝臟和肌肉等組織中[2-5]，提高雞蛋硒含量[6-8]和GSH-Px活性[9-10]。苜蓿中的活性物質(zhì)有增強(qiáng)血清抗氧化能力、降低血清MDA含量以及預(yù)防心血管疾病等作用。添加不同水平的苜?？傔翱梢栽鰪?qiáng)肉雞肝臟和血清GSH-Px活性，降低肝臟和血清MDA含量，使動(dòng)物機(jī)體不被脂質(zhì)過氧化物傷害[11]。Deng等[12]研究表明，含水苜蓿提取物能夠顯著降低血清和肝臟的膽固醇以及蛋黃、血清和肝臟的脂質(zhì)，但對(duì)血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量無顯著影響。Zhou等[13]進(jìn)一步利用數(shù)字基因表達(dá)分析了苜蓿皂苷提取物降低蛋雞膽固醇的效果，發(fā)現(xiàn)添加120 mg/kg苜蓿皂苷提取物效果最好。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加苜草素可降低產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋黃總膽固醇和甘油三酯含量，提高生產(chǎn)性能、蛋殼強(qiáng)度、機(jī)體抗氧化和膽固醇代謝能力，其適宜添加水平為1 000 mg/kg[14]。但有機(jī)硒與苜草素均兼有抗氧化的功效，但其聯(lián)和使用是否會(huì)在雞蛋品質(zhì)、動(dòng)物抗氧化及脂代謝方面產(chǎn)生更好的效果卻鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過在飼糧中添加酵母硒和苜草素，進(jìn)一步探討其對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、硒沉積、抗氧化、膽固醇及相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在確定其適宜添加水平及組合，為提高雞蛋品質(zhì)和蛋雞產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年6月11日至2015年8月21日在山西省大同市大同縣建鑫養(yǎng)殖場(chǎng)和山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與動(dòng)物營養(yǎng)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用苜草素是一種從紫花苜蓿中提取的天然植物提取物，其有效成分為多糖15%、黃酮5%和三萜皂苷5%，購自四川德陽三豐原科技股份有限公司；酵母硒購自奧特奇生物有限公司，硒含量2 000 mg/kg。試驗(yàn)選用756只69周齡健康狀況良好、產(chǎn)蛋率約80%的海蘭褐蛋雞，隨機(jī)分成7組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)18只雞。其中1組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧(硒含量0.20 mg/kg)，參照海蘭公司提供的飼養(yǎng)管理手冊(cè)(2014)并根據(jù)建鑫養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際情況做適當(dāng)修改進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1；2～7組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg酵母硒與500和1 000 mg/kg苜草素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。試驗(yàn)預(yù)試期2周，期間飼喂基礎(chǔ)飼糧；正試期8周。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供 The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 33 000 IU，VD38 100 IU，VK 3 mg，VB13 mg，VB215 mg，VB68.4 mg，VB120.04 mg，D-泛酸鈣D-calcium pantothenate 19.2 mg，煙酸 nicotinic acid 54 mg，D-生物素D-biotin 0.06 mg。

2)微量元素預(yù)混料為每千克飼糧提供 The trace mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Cu (as copper sulfate) 10 mg，Zn (as zinc sulfate) 80 mg，Mn 120 mg，I 0.26 mg。

3)計(jì)算值 Calculated values。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用立體3層籠養(yǎng)，每籠3只，雞只自由采食與飲水，自然光照補(bǔ)充人工光照到16 h；溫度(20±2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，自然通風(fēng)結(jié)合縱向負(fù)壓通風(fēng)；其他均按養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)方法進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生產(chǎn)性能

試驗(yàn)期間每日記錄各重復(fù)的產(chǎn)蛋數(shù)、產(chǎn)蛋總重量，每7 d結(jié)料，記錄各重復(fù)耗料重，計(jì)算各組平均日采食量，然后以組為單位統(tǒng)計(jì)產(chǎn)蛋率和料蛋比。

1.4.2 蛋品質(zhì)測(cè)定

試驗(yàn)第14、28、42和56天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)抽取3枚雞蛋測(cè)定蛋品質(zhì)。采用多功能蛋品質(zhì)測(cè)定儀(ORKA，以色列)測(cè)定蛋重、蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色，采用蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀(ORKA，以色列)測(cè)定蛋殼強(qiáng)度，采用蛋殼厚度測(cè)定儀(NFN380，日本)測(cè)定蛋殼厚度。

1.4.3 血漿及組織相關(guān)指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每重復(fù)隨機(jī)選取1只健康狀況良好且體重接近的蛋雞，空腹翅靜脈采血5 mL，3 500 r/min離心10 min制備血漿分裝，-20 ℃保存。取同一部位肝臟，按照相應(yīng)試劑盒測(cè)定血漿GSH-Px和T-SOD活性、T-AOC、MDA、膽固醇和甘油三酯含量以及肝臟GSH-Px活性、膽固醇和甘油三酯含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 蛋黃相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每重復(fù)選取2枚雞蛋稱重，破殼后分離蛋清蛋黃，使用氫化物發(fā)生原子熒光分析方法測(cè)定蛋黃硒含量；使用試劑盒測(cè)定蛋黃膽固醇和甘油三酯含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.5 肝臟總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

對(duì)上述采血后的雞頸靜脈放血致死，采用無菌操作迅速取出同一部位肝臟放入液氮中，置于-80 ℃待測(cè)。采用Trizol法提取肝臟組織總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳、核酸蛋白儀測(cè)定RNA完整性、濃度和純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)庫中GSH-Px1、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)、硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)的序列，設(shè)計(jì)其引物，由華大基因(北京)合成。

1.4.7 實(shí)時(shí)定量PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析，用Duncan氏法比較各組之間差異，采用LSD法對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行極顯著差異比較，對(duì)mRNA表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表3 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表4可知，各試驗(yàn)組蛋雞平均蛋重和平均日采食量與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)；除3組和6組蛋雞產(chǎn)蛋率與對(duì)照組差異不顯著(P>

0.05)外，其他各試驗(yàn)組蛋雞產(chǎn)蛋率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各試驗(yàn)組蛋雞料蛋比均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中以5組產(chǎn)蛋率最高、料蛋比最低。酵母硒和苜草素互作可極顯著降低蛋雞料蛋比(P<0.01)，有提高蛋雞產(chǎn)蛋率趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no letter or the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)以及蛋黃硒、膽固醇和甘油三酯含量的影響

由表5可知，飼糧中添加酵母硒和苜草素具有提高哈氏單位趨勢(shì)，其中4組哈氏單位顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；2組、4組和5組的蛋殼強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；其余各項(xiàng)蛋品質(zhì)指標(biāo)各組差異不顯著(P>0.05)。蛋黃硒含量隨酵母硒添加量的增加而增加，試驗(yàn)組蛋黃硒含量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；各試驗(yàn)組蛋黃膽固醇和甘油三酯含量均低于對(duì)照組，其中3組和5組蛋黃膽固醇含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，3組、5組和7組蛋黃甘油三酯含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作對(duì)蛋品質(zhì)及蛋黃硒、膽固醇和甘油三酯含量的影響不顯著(P>0.05)。

表5 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)以及蛋黃硒、膽固醇和甘油三酯含量的影響

2.3 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響

由表6可知，試驗(yàn)組蛋雞血漿和肝臟GSH-Px活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)組蛋雞血漿T-SOD活性極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；除2組和3組蛋雞血漿T-AOC與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)外，其余各試驗(yàn)組蛋雞血漿T-AOC均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；2組和4組蛋雞血漿MDA含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，5組蛋雞血漿MDA含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作可極顯著蛋雞提高血漿和肝臟GSH-Px活性及血漿T-SOD活性(P<0.01)，而對(duì)蛋雞血漿T-AOC和MDA含量無顯著影響(P>0.05)。

2.4 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞脂代謝的影響

由表6可知，試驗(yàn)組蛋雞血漿膽固醇含量有降低的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組蛋雞肝臟膽固醇、甘油三酯含量均低于對(duì)照組，其中5組、6組和7組蛋雞肝臟膽固醇與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)組蛋雞肝臟甘油三酯含量與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。酵母硒和苜草素互作對(duì)蛋雞肝臟膽固醇含量影響顯著(P<0.05)，對(duì)蛋雞肝臟甘油三酯含量影響極顯著(P<0.01)。

表6 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血漿和肝臟抗氧化能力以及脂代謝的影響

2.5 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化、脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

由表7可知，飼糧添加酵母硒和苜草素可極顯著提高蛋雞肝臟TrxR1、CYP7A1和SREBP-1cmRNA表達(dá)量(P<0.01)；顯著提高蛋雞肝臟GSH-Px1 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，且隨著酵母硒添加水平的提高其表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；同時(shí)，也極顯著降低蛋雞肝臟HMGCRmRNA表達(dá)量(P<0.01)，以5組最低且顯著低于7組(P<0.05)。

表7 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟抗氧化、脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

3.2 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

評(píng)價(jià)蛋品質(zhì)的常規(guī)指標(biāo)包括蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色等。蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度直接影響雞蛋抗破損能力，蛋白高度和哈氏單位直接反映雞蛋新鮮程度。蛋白高度數(shù)值越大、哈氏單位越高，則表示蛋白品質(zhì)優(yōu)秀，蛋白黏稠度較好。蛋黃顏色主要與蛋雞攝取類胡蘿卜素種類和數(shù)量有關(guān)。

本試驗(yàn)中，酵母硒和苜草素聯(lián)用有提高雞蛋蛋白高度和哈氏單位的趨勢(shì)，當(dāng)添加量到0.6 mg/kg酵母硒+500 mg/kg苜草素時(shí)，哈氏單位與對(duì)照組相比差異顯著，這說明添加這2種添加劑后，體內(nèi)抗氧化作用增強(qiáng)，雞蛋品質(zhì)得到改善。本試驗(yàn)中，蛋殼強(qiáng)度均有不同程度增強(qiáng)，但蛋殼厚度變化無規(guī)律，原因可能是酵母硒和苜草素中的活性物質(zhì)，如酵母、皂苷等，影響了蛋雞體內(nèi)鈣、磷吸收率，從而導(dǎo)致蛋殼密度增大，強(qiáng)度增強(qiáng)，這與Invernizzi等[20]結(jié)果一致。

3.3 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血漿和肝臟抗氧化能力的影響

機(jī)體抗氧化功能主要是通過一系列反應(yīng)清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA、氫過氧化物和H2O2等)，使機(jī)體免受這些自由基損傷的過程。體內(nèi)GSH-Px、T-SOD、T-AOC、MDA、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)等指標(biāo)均反映機(jī)體抗氧化能力。Jing等[10]研究表明，飼糧中添加硒源可提高蛋雞血漿GSH-Px和T-SOD活性，顯著降低血漿MDA含量。Lu等[21]研究表明，機(jī)體補(bǔ)充硒源可增加硫氧還蛋白1和硫氧還蛋白2蛋白表達(dá)量。史瑩華等[11]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加苜蓿皂苷可提高仔豬血清和肝臟等組織中GSH-Px和T-SOD活性，降低MDA含量。

本試驗(yàn)中，酵母硒和苜草素互作極顯著提高了蛋雞血漿GSH-Px、T-SOD活性以及肝臟GSH-Px活性，降低血漿MDA含量，這與上述研究結(jié)論相符；且肝臟中GSH-Px1和TrxR1 mRNA表達(dá)量也表現(xiàn)出與血漿一致的規(guī)律性，這說明酵母硒和苜草素可在基因轉(zhuǎn)錄水平上影響GSH-Px和TrxR的表達(dá)，協(xié)同提高機(jī)體抗氧化酶活性，最終增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

3.4 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞血漿、肝臟、蛋黃膽固醇和甘油三酯含量的影響

肝臟是機(jī)體內(nèi)脂代謝活動(dòng)的重要器官，膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽汁酸是體內(nèi)膽固醇代謝的重要途徑。機(jī)體內(nèi)膽固醇代謝由一系列酶參與調(diào)控，其中CYP7A1是膽汁酸合成的限速酶，對(duì)維持機(jī)體膽固醇穩(wěn)定具有重要作用。SREBP-1c基因?qū)儆诠檀颊{(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族，可促進(jìn)脂肪酸生成并與膽固醇合成膽固醇酯，從而消耗膽固醇[22]。HMGCR是內(nèi)源膽固醇合成過程中的限速酶[23-24]。研究表明，飼糧中添加硒源對(duì)蛋雞血液膽固醇和甘油三酯含量影響不顯著[25]，添加苜草素可降低機(jī)體血液、肝臟膽固醇和甘油三酯含量以及雞蛋中膽固醇的沉積量[12]。Zhou等[13]進(jìn)一步利用數(shù)字基因表達(dá)分析了苜蓿皂苷提取物降低蛋雞膽固醇的效果，認(rèn)為苜蓿皂苷降低膽固醇的作用是由肝臟中的膽固醇流出，降低卵巢中膽固醇的沉積。本試驗(yàn)中，酵母硒和苜草素互作不僅顯著降低了蛋雞肝臟膽固醇和甘油三酯的含量，而且蛋黃中的膽固醇和甘油三酯含量也隨之下降，這與上述研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母硒和苜草素極顯著提高了肝臟中CYP7A1和SREBP-1cmRNA表達(dá)量，極顯著降低了HMGCRmRNA表達(dá)量，原因可能是HMGCRmRNA表達(dá)量的降低直接影響了機(jī)體內(nèi)膽固醇的合成；SREBP-1cmRNA表達(dá)量的升高促進(jìn)了脂肪酸合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，加速了脂肪酸的生成，從而與游離的膽固醇結(jié)合生成膽固醇酯，從而降低了膽固醇[22]；CYP7A1 mRNA表達(dá)量的升高，加快了肝臟膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)變，進(jìn)而降低了卵巢中膽固醇沉積[13]。由此可見，酵母硒和苜草素聯(lián)用既影響了機(jī)體內(nèi)膽固醇的合成，又影響著膽固醇代謝，從而降低了肝臟和蛋黃中膽固醇和甘油三酯含量。

3.5 酵母硒和苜草素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋黃硒含量的影響

現(xiàn)有試驗(yàn)表明，雞蛋中硒含量可隨飼糧中添加硒源水平的升高而升高，其中有機(jī)硒效果優(yōu)于無機(jī)硒[26-27]。而關(guān)于苜草素和酵母硒對(duì)蛋硒含量的影響研究較少，且普遍認(rèn)為苜草素影響機(jī)體對(duì)微量元素的吸收代謝，主要是通過消化道的代謝促進(jìn)機(jī)體對(duì)微量元素(硒、鋅、錳等)的吸收。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加酵母硒和苜草素，蛋黃硒含量極顯著高于對(duì)照組，且隨酵母硒和苜草素添加量的增加，蛋黃硒含量并未趨于平緩或降低。雖然添加1.0 mg/kg酵母硒+500、1 000 mg/kg苜草素組合與0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素組合相比，肝臟抗氧化性能及表達(dá)量極顯著降低，但肝臟中抗氧化指標(biāo)、GSH-Px1和TrxR1 mRNA的表達(dá)量仍極顯著高于對(duì)照組，說明硒添加水平并未超出蛋雞機(jī)體對(duì)硒的耐受力，但以添加0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素組合效果較好。

4 結(jié) 論

產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中添加酵母硒和苜草素可有效提高蛋黃硒含量、降低蛋黃膽固醇和甘油三酯含量，改善蛋殼強(qiáng)度，提高生產(chǎn)性能、機(jī)體抗氧化和膽固醇代謝能力，有提高雞蛋蛋白高度和哈氏單位趨勢(shì)，以添加0.6 mg/kg酵母硒+1 000 mg/kg苜草素組合效果最佳。