鳥類應(yīng)激檢測方法探討

李月珠 郭錦心 王 昱 隋金玲

(北京林業(yè)大學(xué)自然保護(hù)區(qū)學(xué)院，北京100083)

加拿大生理學(xué)家Selye[1]最早對(duì)應(yīng)激進(jìn)行了研究，他指出，當(dāng)面對(duì)環(huán)境應(yīng)激源時(shí)，動(dòng)物機(jī)體為了克服外界和內(nèi)部的各種異常刺激而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，從而保持機(jī)體在極端條件下的平衡。隨后，關(guān)于動(dòng)物應(yīng)激的研究越來越多，其中應(yīng)激研究的指標(biāo)包括糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)水平、免疫功能、代謝、氮平衡等[2]，在鳥類相關(guān)研究中主要圍繞著糖皮質(zhì)激素展開。糖皮質(zhì)激素是由下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸刺激腎上腺皮質(zhì)而分泌的[3]，被視為應(yīng)激激素，因?yàn)楫?dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，血漿中糖皮質(zhì)激素水平必然升高[4]，因此糖皮質(zhì)激素水平被作為重要的應(yīng)激指標(biāo)來反映應(yīng)激水平。鳥類分泌的糖皮質(zhì)激素有95%以上是皮質(zhì)酮，其水平的變化會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成影響。糖皮質(zhì)激素的分泌增加、水平升高在短期正常范圍內(nèi)是有益的，使得動(dòng)物機(jī)體在行為和生理上發(fā)生一系列反應(yīng)以應(yīng)對(duì)應(yīng)激源，有利于動(dòng)物擺脫生命危險(xiǎn)[5-6]。然而，對(duì)HPA軸的長期慢性刺激，使糖皮質(zhì)激素水平上升，動(dòng)物機(jī)體長期處于應(yīng)激狀況下會(huì)對(duì)其健康造成很大的不利影響，如降低機(jī)體的認(rèn)知能力[7]、免疫能力[3-8]、體質(zhì)水平[9]和繁殖能力[10]，進(jìn)而降低存活率，從而影響野生動(dòng)物的種群動(dòng)態(tài)[11]。對(duì)激素的測定可以幫助我們了解惡劣氣候、食物資源匱乏、捕食者的攻擊恐嚇、種間競爭以及人類對(duì)棲息地的破壞是如何影響野生動(dòng)物的生存和繁殖的[12-16]。

早期的糖皮質(zhì)激素檢測主要是采集動(dòng)物的血液樣本，這也是應(yīng)用最廣泛的采樣技術(shù)，然而這樣的過程對(duì)鳥類是一個(gè)干擾和刺激，會(huì)使糖皮質(zhì)激素水平在短時(shí)間內(nèi)升高，從而使得檢測到的不是“基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素”水平；同時(shí)，在野外條件下快速獲得血液樣品也是很難實(shí)現(xiàn)的。這些限制，使得一些新的長期監(jiān)測手段相繼發(fā)展，如對(duì)排泄物中糖皮質(zhì)激素的代謝產(chǎn)物以及羽毛中皮質(zhì)酮水平的檢測[17]。但目前，在我國對(duì)鳥類應(yīng)激狀況的監(jiān)測主要通過血液和糞便，對(duì)羽毛糖皮質(zhì)激素的檢測及其生態(tài)學(xué)研究尚屬于空白。本文將從血液、糞便和羽毛這3種采樣技術(shù)入手，介紹當(dāng)前糖皮質(zhì)激素檢測的研究現(xiàn)狀，旨在為鳥類應(yīng)激狀況監(jiān)測提供一定的參考，為野生鳥類保護(hù)作出一點(diǎn)貢獻(xiàn)。

1 糖皮質(zhì)激素的測定手段

1.1 血液樣本

血液糖皮質(zhì)激素可以反映出鳥類游離態(tài)的和總的糖皮質(zhì)激素水平[18]。動(dòng)物血漿和血清中糖皮質(zhì)激素水平是相同的[19]，而且也是極其穩(wěn)定的，在-20 ℃下保存數(shù)十年也不會(huì)變質(zhì)[20]，為了保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，建議把捕捉后激素檢測的時(shí)間擬定為5 min至數(shù)小時(shí)內(nèi)[21]。鳥類血液樣本的采集一般采用翼下靜脈采血的方法[22]，采集以后在-20 ℃條件下保存，并且在24 h內(nèi)完成離心[2]，以盡可能的減少激素的代謝。鳥類血液中糖皮質(zhì)激素的水平一般為幾納克/毫升(ng/mL)[23]。使用血液作為測定材料有2個(gè)方面的優(yōu)勢：第一，直接測定的是腎上腺皮質(zhì)的產(chǎn)物——糖皮質(zhì)激素的水平，而不是被分解或者排泄出的代謝物[2]；第二，可以同時(shí)收集一整套的血液成分，從而對(duì)鳥類的狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)估，包括皮質(zhì)酮結(jié)合蛋白(CBG)[24]、棕櫚酸酯和葡萄糖[25]、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞[3,8]、免疫球蛋白[26]、血漿肌酸激酶[27]、睪酮[24,28]、孕酮[29]、雌二醇[30]等，以上這些指標(biāo)都會(huì)隨著動(dòng)物對(duì)應(yīng)激源的反應(yīng)而改變。測定血液糖皮質(zhì)激素水平是最常用的手段，然而它卻不是最有效的方法，甚至有時(shí)候是不必要的[31]。血液糖皮質(zhì)激素水平反映的是動(dòng)物短時(shí)期內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平的變化，而不是對(duì)一段時(shí)間(幾天至幾周)內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平的綜合檢測[16]。

影響血液中糖皮質(zhì)激素檢測的因素包括如下7個(gè)方面：1)樣本的可信度。最大的問題是研究人員在捕捉和處理過程中會(huì)引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，由于樣品采集以及試驗(yàn)者誘發(fā)激素釋放，最終只能反映短時(shí)間范疇內(nèi)糖皮質(zhì)激素的狀況[13]。糖皮質(zhì)激素的水平一般在施加應(yīng)激源15～30 min內(nèi)達(dá)到最大值，在60～90 min內(nèi)恢復(fù)到基本水平[32]。有研究通過比較3和4 min內(nèi)采集的血液樣本，發(fā)現(xiàn)它們之間的差異較小，結(jié)果相似，均為基礎(chǔ)的糖皮質(zhì)激素水平[33]。因此，為了盡可能的使測定的激素為“基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素”，必須在動(dòng)物被捕捉后3～5 min內(nèi)進(jìn)行血樣采集[28,34-35]，但在野外條件下快速獲得樣本是很難實(shí)現(xiàn)的。2)樣本量。以血液為樣本時(shí)，一般采集50～100 μL血液[35]，一些小型鳥類由于受本身血量的限制，對(duì)其血液采樣十分困難。3)難以捕捉。對(duì)于一些離岸時(shí)間較長的動(dòng)物，如海鳥，它在陸地繁殖時(shí)間較短，對(duì)血液樣本的采集難以實(shí)施[16]。4)取樣頻率。對(duì)動(dòng)物頻繁的捕捉和采集血液樣本，會(huì)使它們習(xí)慣這樣的處理，從而減少應(yīng)激反應(yīng)[36]。5)季節(jié)性(生理期)的變化。血漿中基礎(chǔ)的和應(yīng)激性的皮質(zhì)酮水平隨著季節(jié)變化而變化[37]。6)血液糖皮質(zhì)激素水平在不同時(shí)間點(diǎn)有波動(dòng)，受晝夜節(jié)律，或者其他小的干擾引起的短期變化影響較大[2]。7)光周期的變化。血清皮質(zhì)酮水平受光周期和光刺激的影響較顯著，中光照周期條件下灰文鳥(Lonchuraoryzivora)皮質(zhì)酮激素對(duì)光刺激的響應(yīng)在長、短光照周期條件下明顯不同[38]。

1.2 糞便樣本

糞便采樣作為一種非損傷采樣技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在激素的檢測之中。血液糖皮質(zhì)激素普遍通過肝臟代謝，通過腎臟分泌進(jìn)入尿液或通過膽管進(jìn)入腸道[39]，形成糞便糖皮質(zhì)激素代謝物(fecal glucocorticoid metabolites,FGM)，F(xiàn)GM水平與血液基礎(chǔ)糖皮質(zhì)激素水平密切相關(guān)，它反映了血液基礎(chǔ)游離糖皮質(zhì)激素水平的變化情況[40]，故而FGM水平作為一個(gè)有價(jià)值的非損傷性采樣技術(shù)而獲得的數(shù)據(jù)，可以用來檢測激素水平，反映動(dòng)物的應(yīng)激狀況。糞便中糖皮質(zhì)激素水平變化滯后于血液中糖皮質(zhì)激素水平變化，鳥類的滯后時(shí)間一般是1～2 h[41]。由于鳥類泄殖腔的特殊構(gòu)造，糞便和尿液是一起排出體外的，雖然以前的研究建議收集整個(gè)糞便和其他排泄物，但糖皮質(zhì)激素水平在它們之間是難以界定的[42]。使用糞便樣本作為測定材料，有以下優(yōu)勢：第一，糞便采樣作為一項(xiàng)非損傷性采樣技術(shù)，不需要像采集血液那樣對(duì)動(dòng)物進(jìn)行捕捉，更容易獲得，可降低對(duì)動(dòng)物的干擾[39]；第二，糞便中糖皮質(zhì)激素水平變化滯后于血液中糖皮質(zhì)激素水平變化，采集糞樣的時(shí)候，糖皮質(zhì)激素已經(jīng)存在于糞便之中[39,41]，采樣不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響；第三，糞便糖皮質(zhì)激素水平反映的是一段時(shí)間內(nèi)的平均水平，而不是瞬時(shí)水平[43]；第四，糞樣便于頻繁、連續(xù)采集，甚至長期采集，有利于對(duì)動(dòng)物應(yīng)激狀況進(jìn)行長期監(jiān)測[39,44]。糞便不能像血液那樣提供更多的檢測指標(biāo)，不過同樣的糞便樣本除了測定糖皮質(zhì)激素外，也可進(jìn)行基因、睪酮、孕酮、雌二醇、免疫球蛋白等的研究[41,44-45]。研究指出，糞便糖皮質(zhì)激素水平可以反映鳥類的生殖狀況、免疫狀況，并可監(jiān)測環(huán)境壓力和人為干擾對(duì)鳥類產(chǎn)生的影響[44,46]。

影響糞便中糖皮質(zhì)激素檢測的因素表現(xiàn)在如下4個(gè)方面：1)糞便采集以后的保存條件和樣品的新鮮程度都會(huì)影響糖皮質(zhì)激素水平測定的準(zhǔn)確性，因?yàn)槲⑸飼?huì)降解糖皮質(zhì)激素，特別是在野外惡劣環(huán)境下影響更大，因此樣品采集后應(yīng)盡快于-20 ℃冷凍保存[47-48]，另外還有室溫或低溫條件下酒精保存[49]、風(fēng)干[41,50]、立即提取和保存在固相萃取暗盒[51]的方法。2)不同季節(jié)，鳥類食物不同，可能會(huì)改變腸道微生物群落，從而改變糖皮質(zhì)激素的代謝，使得糞便糖皮質(zhì)激素水平呈季節(jié)性變化[52]，日照長度也可能會(huì)使鳥類糞便糖皮質(zhì)激素水平呈現(xiàn)季節(jié)性變化[53]，因此，在長期監(jiān)測研究中，完整糞便樣本的采集極為重要。3)鳥類糞便排泄較頻繁，激素在腸道中停留的時(shí)間較短，糞便糖皮質(zhì)激素會(huì)受日節(jié)律的影響[48]，為此，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測時(shí)，應(yīng)取同一時(shí)間段內(nèi)的糞便樣品來進(jìn)行比較分析[53]。4)對(duì)鳥類糞便中糖皮質(zhì)激素進(jìn)行檢測時(shí)，為了不影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確性，樣本量干重至少要有20 mg[54]，這對(duì)于小型鳥類是難以實(shí)現(xiàn)的，可以通過1 d內(nèi)多次采集來避免樣品量不足而造成的影響[53]。然而，對(duì)野生鳥類糞便的取樣是極其困難的，很多鳥類糞便的量很少，而且不容易采集。

1.3 羽毛樣本

Bortolotti等[35]最先通過檢測羽毛皮質(zhì)酮水平來反映鳥類的內(nèi)分泌狀況，證實(shí)了通過羽毛皮質(zhì)酮水平來反映鳥類的長期生理應(yīng)激狀況是可行的，羽毛具有再生能力，換羽或者摘除某一特定位置的羽毛，一段時(shí)間以后新的羽毛就會(huì)長出來，通過檢測其羽毛皮質(zhì)酮水平，就可以反映出這段時(shí)間內(nèi)鳥類的應(yīng)激水平。生長羽毛的細(xì)胞是高度血管化的，成熟以后會(huì)死亡，羽毛生長過程中激素通過血液進(jìn)入到羽毛中，羽毛角質(zhì)化以后激素便存儲(chǔ)在其中，羽毛皮質(zhì)酮水平反映了羽毛生長期間基礎(chǔ)的和應(yīng)激產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素的綜合水平[35]。羽毛對(duì)動(dòng)物提供了最長時(shí)間的糖皮質(zhì)激素監(jiān)測樣本，其緩慢的增長意味著對(duì)激素提供了一個(gè)時(shí)間尺度上的測量，這個(gè)時(shí)間段取決于羽毛的生長周期，通常是幾天、幾周或者幾個(gè)月。目前關(guān)于羽毛皮質(zhì)酮的形成機(jī)制，普遍認(rèn)同的是Bortolotti等[35]的觀點(diǎn)，認(rèn)為羽毛中的皮質(zhì)酮來自于血液，這在后來的研究當(dāng)中也得到一些證實(shí)。Lattin等[17]給9只紫翅椋鳥(Sturnusvulgaris)的肩胛骨之間植入結(jié)晶狀皮質(zhì)酮，另外11只作為對(duì)照組而未植入，發(fā)現(xiàn)羽毛生長期間，血漿皮質(zhì)酮水平與羽毛皮質(zhì)酮水平有對(duì)應(yīng)關(guān)系，植入結(jié)晶狀皮質(zhì)酮后鳥類血漿皮質(zhì)酮水平升高了，對(duì)應(yīng)的鳥類羽毛皮質(zhì)酮水平也顯著高于無植入物的對(duì)照組。Fairhurst等[33]通過外源植入物來增加雙色樹燕(Tachycinetabicolor)皮質(zhì)酮水平，試驗(yàn)采集了7、9、11日齡的多份血液樣本，在動(dòng)物捕捉4 min內(nèi)采集血液作為基礎(chǔ)皮質(zhì)酮樣本，在動(dòng)物捕捉后30 min采集血液作為應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的皮質(zhì)酮樣本，發(fā)現(xiàn)羽毛皮質(zhì)酮水平可以反映血液中基礎(chǔ)的和應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的皮質(zhì)酮水平，但只有當(dāng)血漿皮質(zhì)酮水平顯著變化而且維持一段時(shí)間時(shí)才能反映在羽毛皮質(zhì)酮水平中。盡管血漿皮質(zhì)酮和羽毛皮質(zhì)酮水平之間有一定的相關(guān)性，但并不能使用羽毛皮質(zhì)酮水平來直接推斷短時(shí)間內(nèi)血漿皮質(zhì)酮水平的變化，羽毛皮質(zhì)酮水平應(yīng)成為獨(dú)立的糖皮質(zhì)激素生理學(xué)測量指標(biāo)[55]。有研究認(rèn)為，羽毛中的皮質(zhì)酮來自于體表或與金屬[鎘(Cd)、錳(Mn)、鈷(Co)、銅(Cu)、鉬(Mo)]和非金屬的富集有關(guān)，金屬會(huì)影響鳥類應(yīng)激軸的活性，但對(duì)羽毛皮質(zhì)酮的具體影響機(jī)制還不清楚[56]，目前也還沒有研究證明鳥類體表能產(chǎn)生皮質(zhì)酮[57]。皮質(zhì)酮通過血液擴(kuò)散到羽毛中，血液皮質(zhì)酮水平通常是在納克(ng)數(shù)量級(jí)，而羽毛皮質(zhì)酮?jiǎng)t是皮克(pg)數(shù)量級(jí)，這說明沉積過程有一個(gè)限制因素或者瓶頸發(fā)生[55]。雖然目前對(duì)羽毛皮質(zhì)酮的形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚且不完善，但關(guān)于測定羽毛皮質(zhì)酮可以作為應(yīng)激反應(yīng)的一項(xiàng)長期監(jiān)測手段是普遍認(rèn)同的觀點(diǎn)。

采集羽毛進(jìn)行糖皮質(zhì)激素的檢測，有以下優(yōu)勢：第一，羽毛皮質(zhì)酮作為激素測定的一個(gè)微損傷或非損傷取樣研究手段，相比較血液損傷更小、更容易采集獲得；第二，羽毛皮質(zhì)酮水平可以反映整個(gè)應(yīng)激時(shí)間段的糖皮質(zhì)激素水平，提供最長時(shí)間范圍的應(yīng)激監(jiān)測；同時(shí)，綜合檢測也減少了區(qū)分基礎(chǔ)的和應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素水平的必要，更關(guān)注于個(gè)體的整體水平變化[33]；第三，羽毛皮質(zhì)酮在羽毛生長階段就已經(jīng)形成了[35]，比較穩(wěn)定，對(duì)其進(jìn)行采集的時(shí)候，不會(huì)對(duì)檢測結(jié)果造成影響；第四，羽毛樣品采集后，儲(chǔ)存在室溫條件下，長期保存仍然可以用于皮質(zhì)酮的檢測。Kennedy等[58]的研究中，采集了博物館在1964—1966年收藏的紅翅黑鸝(Agelaiusphoeniceus)標(biāo)本的羽毛，用來分析羽毛色素沉積與羽毛皮質(zhì)酮水平之間的關(guān)系。Fairhust等[59]則評(píng)估了1859—2002年143年間羽毛皮質(zhì)酮水平變化的趨勢。在-20 ℃低溫下保存的羽毛樣本也可用于檢測[56]，目前還沒有證據(jù)證明羽毛皮質(zhì)酮水平會(huì)隨時(shí)間的推移而逐漸減少。從羽毛中提取皮質(zhì)酮的回顧性檢測開辟了新的研究途徑，可以從各種時(shí)間背景保存下來的標(biāo)本取樣，包括已滅絕的物種，進(jìn)行皮質(zhì)酮的生理性研究，對(duì)于理解歷史上發(fā)生的生態(tài)事件具有重要意義[59]。

影響羽毛糖皮質(zhì)激素檢測的因素有如下4個(gè)方面：1)樣品量。Lattin等[17]采集了4只紫翅椋鳥(S.vulgaris)的138根羽毛，分別將每只鳥的羽毛除去羽根后切成小塊，用球磨機(jī)粉碎直至呈粉末狀，并將這些粉末充分混合，取3(大概相當(dāng)于紫翅椋鳥的1/8根初級(jí)飛羽)～99 mg(大概相當(dāng)于4根完整的初級(jí)飛羽)重量范圍的羽毛粉末，檢測其皮質(zhì)酮水平，發(fā)現(xiàn)羽毛樣品低于20 mg時(shí)，測量結(jié)果偏高，之后才相對(duì)穩(wěn)定一些，當(dāng)羽毛樣品大于20 mg的時(shí)候才能避免重量帶來的問題。因此，實(shí)際情況下，當(dāng)羽毛量較少，或者小型鳥類的羽毛量不能保證時(shí)，為了避免小樣本問題，減少誤差，建議在試驗(yàn)中將樣品重量統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。2)采集部位。采集羽毛樣本時(shí)，一般采集飛羽或背羽。同一只鳥同一時(shí)期生長出來的相鄰羽毛[17,56]，或者左右對(duì)稱(次級(jí)飛羽的第5根)的2片羽毛皮質(zhì)酮水平相同[56]。不同的羽毛類型，如飛羽和體羽，換羽時(shí)間是不一樣的，檢測不同類型羽毛的皮質(zhì)酮水平反映的是不同的生命歷史階段的狀況[60]。3)激素的提取。首先是羽毛的處理，一般是剪碎，或者直接粉碎，后一種方法通過增加樣本與溶劑的接觸面積，可以提高激素的萃取率[2]。羽毛皮質(zhì)酮的提取技術(shù)一般是利用甲醇來萃取。Kouwenberg等[16]發(fā)現(xiàn)在用酶聯(lián)免疫分析檢測皮質(zhì)酮水平的試驗(yàn)中，通過甲醇萃取后，再用乙腈(甲基氰)/己烷進(jìn)行萃取，通過后者純化去除了影響試驗(yàn)分析的化合物，使得皮質(zhì)酮檢測精度更高，結(jié)果誤差更小(經(jīng)乙腈/己烷萃取的樣品重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著，只進(jìn)行甲醇萃取的樣品重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果差異顯著，所得皮質(zhì)酮水平差異較大)，且萃取回收率為87%，進(jìn)一步萃取不會(huì)造成大量的皮質(zhì)酮損失。4)使用的抗體。Lattin等[17]使用Sigma抗體得到的羽毛皮質(zhì)酮水平范圍為2.4[紅尾鵟(Buteojamaicensis)]～6.7 pg CORT/mm[紫翅椋鳥(S.vulgaris)]，而使用Endocrine Sciences抗體無法檢測出羽毛中的皮質(zhì)酮；Sigma抗體比Endocrine Sciences抗體有更高的交叉反應(yīng)性，尤其是與類固醇物質(zhì)之間，比如孕酮、脫氧皮質(zhì)酮、睪酮，所以在抗體的選用時(shí)需要謹(jǐn)慎。

2 糖皮質(zhì)激素各研究手段的評(píng)價(jià)

現(xiàn)階段，隨著采樣技術(shù)從血液擴(kuò)展到糞便和羽毛，對(duì)鳥類應(yīng)激反應(yīng)的研究也不斷展開，但各種手段也存在著一定的局限性：1)從對(duì)動(dòng)物造成的損傷性來看，血液采樣對(duì)于動(dòng)物造成的刺激最大，羽毛次之，糞便采樣作為一個(gè)非損傷手段，不需要捕捉即可獲得，很大程度上降低了對(duì)動(dòng)物的干擾。2)從樣品獲取的難易程度看，除籠養(yǎng)的鳥類，很難采集野外生存的鳥類的糞便；野生鳥類的血液和羽毛采集需要捕捉，對(duì)于一些小型鳥類的血液采樣是很困難的，因而羽毛的采樣方法顯得尤為重要，對(duì)羽毛樣本進(jìn)行采集容易得多，鳥類都有換羽的習(xí)性，羽毛脫落后有再生的功能，采集一定量的完全長成的羽毛不會(huì)對(duì)鳥類的飛行和生存造成影響。另外，館藏的標(biāo)本、實(shí)驗(yàn)室凍藏的鳥類尸體等均可采集羽毛作為試驗(yàn)材料[61]。對(duì)于還處于生長期的羽毛，采集體羽會(huì)影響鳥類的體溫調(diào)節(jié)，采集飛羽會(huì)帶來一些不利因素[62]。3)從保存條件來看，血液樣本需要在-20 ℃的條件下進(jìn)行保存，糞便需要低溫凍存、酒精保存、風(fēng)干保存等，只有羽毛的保存沒有特殊要求，在室溫干燥條件下保存即可，不需要像血液和糞便那樣需要特殊的保存和運(yùn)輸儀器，大大減少了時(shí)間和金錢成本。4)從樣品的用途來看，通過血液可以檢測一整套的生理生化指標(biāo)，直觀地顯示了其健康程度、身體狀況，更全面地反映了鳥類的應(yīng)激水平；雖然新鮮的糞便和羽毛除了進(jìn)行激素的檢測外，也可以進(jìn)行基因等的研究，但血液樣品用途更廣。5)從監(jiān)測時(shí)間來看，由于研究者的操作問題，血液糖皮質(zhì)激素短時(shí)間內(nèi)就會(huì)引起應(yīng)激反應(yīng)，很可能使得最終反映的是短時(shí)間內(nèi)糖皮質(zhì)激素的狀況[13]，而且血液糖皮質(zhì)激素水平本身反映的是動(dòng)物瞬時(shí)的變化，而不是一段時(shí)間(幾天至幾周)內(nèi)的綜合變化[16]。糞便糖皮質(zhì)激素水平能反映一段時(shí)間內(nèi)的應(yīng)激狀況，而羽毛皮質(zhì)酮水平反映的是羽毛生長這段時(shí)間的整體水平，能夠提供更長時(shí)間的應(yīng)激監(jiān)測。

血液、糞便和羽毛作為3種獨(dú)立的測量糖皮質(zhì)激素水平的樣品，并非互相沖突，它們的研究可以取長補(bǔ)短，相互印證。血液、糞便、羽毛采樣技術(shù)的比較見表1。從樣本獲取及其他因素綜合來看，羽毛激素測定為長期環(huán)境壓力評(píng)判提供了一個(gè)很好的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)需要對(duì)應(yīng)激水平進(jìn)行長期監(jiān)測時(shí)，羽毛皮質(zhì)酮水平是一個(gè)有效的指標(biāo)，提供了對(duì)個(gè)體以及種群層面上的時(shí)間尺度的應(yīng)激檢測[35]。當(dāng)血液樣本不可獲得時(shí)，羽毛樣本提供了另外的選擇，但對(duì)于短期內(nèi)、瞬間的監(jiān)測并不適用，而且血液可以同時(shí)收集一整套的血液成分，可以對(duì)鳥類的狀態(tài)進(jìn)行綜合評(píng)估。在激素研究中，采集羽毛可以作為血液樣品的補(bǔ)充而不是替代[55]。同樣，糞便作為應(yīng)激檢測的一項(xiàng)非損傷采樣技術(shù)，不需要捕捉即可采集，大大降低了對(duì)動(dòng)物的干擾，這是其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。所以，建議羽毛采樣可以作為血液和糞便采樣的補(bǔ)充手段，共同作用于鳥類應(yīng)激狀況研究當(dāng)中。然而，對(duì)于一些野外生存的小型鳥類，血液和糞便都難以采集到，這種程度下羽毛采樣其實(shí)就是一個(gè)替代手段來監(jiān)測鳥類的應(yīng)激狀況。另外，研究者可以對(duì)同一種鳥類做3種不同采樣技術(shù)的研究，對(duì)各自的結(jié)果進(jìn)行比較分析，得出更加全面的結(jié)論，這樣可使我們對(duì)鳥類的應(yīng)激狀況有更深入的認(rèn)識(shí)。這種結(jié)果也使我們對(duì)不同采樣技術(shù)的研究結(jié)果的誤差有更加恰當(dāng)?shù)脑u(píng)估，從而使不同采樣技術(shù)的研究都有所改進(jìn)和發(fā)展，減少自身局限性。

表1 血液、糞便、羽毛采樣技術(shù)的比較

3 羽毛皮質(zhì)酮的應(yīng)用及生態(tài)學(xué)意義

羽毛皮質(zhì)酮水平可以用來反映鳥類的生理應(yīng)激狀況，在鳥類研究過程中，經(jīng)常會(huì)有一些難以開展的研究，如冬季遠(yuǎn)洋鳥類、消除直接的或者調(diào)查者誘發(fā)的不良狀況、血液激素的疫病分析等方面，在這些方面羽毛皮質(zhì)酮水平都可以作為一個(gè)較好的手段來進(jìn)行監(jiān)測[35]。通過檢測羽毛皮質(zhì)酮水平，可以顯示鳥類如何應(yīng)對(duì)環(huán)境的干擾，適應(yīng)不同的生命歷史階段[35]。羽毛皮質(zhì)酮作為激素測定的一個(gè)微損傷或非損傷性采樣研究手段，具有可行性和實(shí)用性等特點(diǎn)。目前，與羽毛皮質(zhì)酮相關(guān)的研究包括鳥類的身體狀況[16,63]、羽毛質(zhì)量[17]、營養(yǎng)狀況[16]、環(huán)境豐容[64-65]、繁殖能力[33,66]、巢箱微氣候[67]、碳穩(wěn)定同位素[68-69]、睪酮和寄生蟲對(duì)性別裝飾物的影響程度[70]、色素沉積[58,60,71]、石油影響[72]、寄生蟲感染[73]、城市化[74]等。

3.1 羽毛皮質(zhì)酮水平與鳥類身體狀態(tài)的相關(guān)性

羽毛皮質(zhì)酮水平變化會(huì)影響鳥類的繁殖成功率，比如繁殖能力、出飛率、產(chǎn)卵數(shù)等。繁殖能力低的鳥類羽毛皮質(zhì)酮水平較高[66]，羽毛皮質(zhì)酮水平會(huì)影響雛鳥的出飛率和出飛日期，羽毛皮質(zhì)酮水平低雛鳥的出飛率更高，出飛更早[33]。雌鳥羽毛中的皮質(zhì)酮水平高，則會(huì)影響當(dāng)年的產(chǎn)卵數(shù)，但對(duì)下一年無影響，雄鳥黑色羽毛的數(shù)量作為一個(gè)社會(huì)等級(jí)信號(hào)，與皮質(zhì)酮水平呈正相關(guān)關(guān)系[35]。

羽毛皮質(zhì)酮水平變化反映了鳥類的健康狀況，影響鳥類的生長和發(fā)育。換羽期間，皮質(zhì)酮水平升高會(huì)導(dǎo)致羽毛質(zhì)量降低[17]。雛鳥羽毛皮質(zhì)酮水平高的，其體型和體重都較小，離巢初飛的可能性更小[33]。猛禽中存在羽毛皮質(zhì)酮水平與身體大小呈負(fù)相關(guān)的情況，這表明體型較大的鳥類可能經(jīng)歷較少的自我平衡挑戰(zhàn)，或者能更好地應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力[75]。

羽毛皮質(zhì)酮水平可以反映出鳥類在不同的生活史階段以及個(gè)體所受的壓力和應(yīng)對(duì)策略的變化情況。López-Jiménez等[75]對(duì)不同年齡的黑鳶(Milvusmigrans)進(jìn)行了羽毛皮質(zhì)酮水平檢測，結(jié)果顯示最年幼的個(gè)體羽毛皮質(zhì)酮水平最高，其后隨年齡增長有逐漸下降的趨勢，在7～11歲時(shí)降至最低水平，而后在最高齡個(gè)體(≥12歲)中略有上升，表明了羽毛皮質(zhì)酮水平能捕捉到鳥類在生活史中經(jīng)歷的最脆弱、最具挑戰(zhàn)性的時(shí)期。圈養(yǎng)條件下的紅腿石雞(Alectorisrufa)，在繁殖前期，當(dāng)人接近籠舍時(shí)即表現(xiàn)出明顯的受驚并出現(xiàn)逃避的行為，但當(dāng)孵卵期開始時(shí)，對(duì)人的靠近表現(xiàn)出更高的耐受性，此時(shí)的羽毛皮質(zhì)酮水平較繁殖前期偏低[35]。

羽毛皮質(zhì)酮水平可以作為預(yù)測個(gè)體存活率的指標(biāo)。Koren等[76]在秋季捕獲家麻雀(Passerdomesticus)取得肋部羽毛，并在隨后的冬季追蹤這些個(gè)體的存活率，發(fā)現(xiàn)羽毛皮質(zhì)酮水平和存活率存在反比的關(guān)系，羽毛皮質(zhì)酮水平較高的個(gè)體存活率顯著低于水平較低的個(gè)體。

3.2 影響羽毛皮質(zhì)酮水平的生態(tài)因素

羽毛皮質(zhì)酮水平與很多生態(tài)因素有關(guān)，比如食物和營養(yǎng)狀況、天氣和氣候變化、生境狀況等，為許多問題的研究提供了新的角度。

食物匱乏使得鳥類的生存條件變得惡劣，從而影響鳥類羽毛皮質(zhì)酮水平。Will等[66]對(duì)角嘴海雀(Cerorhincamoncerata)的研究發(fā)現(xiàn)羽毛皮質(zhì)酮水平與體重增長量相關(guān)，限制鳥類飲食，使得羽毛皮質(zhì)酮水平升高。Kouwenberg等[16]的研究發(fā)現(xiàn)北極海鸚(Fraterculaarctica)雛鳥羽毛中的皮質(zhì)酮水平受營養(yǎng)狀況影響，營養(yǎng)狀況好的雛鳥羽毛皮質(zhì)酮水平低，食物攝取少的雛鳥羽毛皮質(zhì)酮水平高，皮質(zhì)酮水平的升高有可能會(huì)促進(jìn)雛鳥的乞食行為。

氣候變化會(huì)影響鳥類羽毛皮質(zhì)酮水平。Legagneux等[15]以溫度、降水和北大西洋濤動(dòng)為環(huán)境因子，通過5年的監(jiān)測研究發(fā)現(xiàn)，歐絨鴨(Somateriamollissima)的羽毛皮質(zhì)酮水平受外部環(huán)境條件的影響較大，而與繁殖投入、繁殖時(shí)間和繁殖前期身體狀況沒有聯(lián)系。環(huán)境條件是影響歐絨鴨換羽期應(yīng)激反應(yīng)的最重要主要因素，夏季和秋初的覓食條件會(huì)影響換羽期間皮質(zhì)酮水平。換羽期或換羽前期是雌性重新補(bǔ)充能量的時(shí)間段，氣溫的改變使得它們的食物(主要是水生生物)在質(zhì)量和數(shù)量上發(fā)生變化，從而氣候變化導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。

城市化對(duì)不同物種的影響有差異，這種差異體現(xiàn)在鳥類的生理應(yīng)激水平變化上。通過檢測穴小鸮(Athenecunicularia)的尾羽皮質(zhì)酮水平，發(fā)現(xiàn)城市和農(nóng)村鳥類的羽毛皮質(zhì)酮水平基本相同，這表明城市生活并不會(huì)增加鳥類的生理應(yīng)激，進(jìn)一步表明鳥類在各種棲息地中個(gè)體的分布是非隨機(jī)的[74]。

4 小結(jié)與展望

羽毛皮質(zhì)酮水平檢測作為鳥類應(yīng)激的一個(gè)長期的監(jiān)測手段，可以監(jiān)測天氣和氣候、食物資源、生境狀況變化這些外在干擾對(duì)鳥類的影響。但目前仍有一些還沒有解決的問題：1)關(guān)于皮質(zhì)酮在羽毛中的擴(kuò)散機(jī)制問題。皮質(zhì)酮通過血液擴(kuò)散到羽毛中，這個(gè)過程有一個(gè)限制因素或者瓶頸發(fā)生，但是具體機(jī)制目前還不是很清楚。關(guān)于羽毛皮質(zhì)酮形成機(jī)制還需要繼續(xù)研究，全面地理解影響和限制皮質(zhì)酮沉積的因素應(yīng)該成為未來研究的重點(diǎn)。2)關(guān)于采樣所取的羽毛是否具有代表性的問題。在對(duì)羽毛皮質(zhì)酮水平檢測的試驗(yàn)中，一般采集飛羽或者體羽，但是關(guān)于采集的羽毛是否具有代表性的問題還不清楚，取某一特定地方的羽毛是否能代表這只鳥類的激素水平？一些雁鴨類鳥類，在每年的夏末繁殖期結(jié)束后，所有的飛羽同時(shí)換羽。但對(duì)于不是同時(shí)換羽的鳥類來說，換羽時(shí)間的差異是否會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響？雖然同一只鳥同一時(shí)期生長出來的相鄰或者對(duì)稱的2根飛羽皮質(zhì)酮水平相等，但初級(jí)飛羽與次級(jí)飛羽或者三級(jí)飛羽，這些羽毛之間的皮質(zhì)酮水平差異性不得而知。此外，關(guān)于羽毛皮質(zhì)酮的生態(tài)學(xué)意義也是未來研究的重點(diǎn)。