植物多糖通過核因子κB及絲裂原活化蛋白激酶/核因子E2相關(guān)因子2信號通路發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制

王麗雪 解玉懷 楊維仁 楊在賓 張桂國

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安271018)

畜禽生長過程中環(huán)境變化、飼糧改變、疾病以及異物代謝等因素均可產(chǎn)生氧化應(yīng)激,其主要特征表現(xiàn)為體內(nèi)產(chǎn)生以活性氧(reactive oxygen species，ROS)為主的大量自由基。正常情況下，動(dòng)物體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)能夠抵御氧化應(yīng)激的損傷，低強(qiáng)度的氧化應(yīng)激能激活細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，如提高抗氧化酶的活性或降低氧化酶活性。應(yīng)激強(qiáng)度持續(xù)增強(qiáng)后，細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)氧化物與抗氧化物的平衡狀態(tài)被打亂，機(jī)體調(diào)控抗氧化的能力不足。補(bǔ)充外源性生物活性物質(zhì)或抗氧化劑增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，是減緩氧化應(yīng)激的有效途徑。生產(chǎn)中通常應(yīng)用化學(xué)合成抗氧化劑，這類抗氧化劑具有高溫易變性、致癌及藥物殘留的缺點(diǎn)。因此，尋求無污染、高效的外源添加的植物源性抗氧化劑成為畜禽生產(chǎn)過程中緩解氧化應(yīng)激行之有效的方法。

1 植物多糖的特殊結(jié)構(gòu)

植物多糖是植物提取物中的一種重要活性成分，具有多種生物學(xué)作用。其生物活性與其特殊的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。

多糖的一級結(jié)構(gòu)是指單糖與糖基的組成、排列順序、糖苷鍵類型、糖鏈長短以及功能性基團(tuán)。植物多糖由葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖以及木糖等單糖構(gòu)成，不同于淀粉等常規(guī)碳水化合物，植物多糖常以α-1,4-、β-1,3-、β-1,4-和α-1,6-苷鍵相連。結(jié)構(gòu)單位可以連成直鏈，也可以形成支鏈，直鏈一般以α-1,4-苷鍵和β-1,4-苷鍵連成，支鏈的連接點(diǎn)常是α-1,6-苷鍵[1]。植物多糖的一級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，糖基上常連接一些包括磷酸基團(tuán)、硫酸基團(tuán)、甲基化基團(tuán)在內(nèi)的功能團(tuán)。植物多糖的高級結(jié)構(gòu)是在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各側(cè)鏈通過非共價(jià)鍵相互作用而形成復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)下，多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合成聚合體。三級結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步盤曲，折疊而形成的空間構(gòu)象。多糖的四級結(jié)構(gòu)是指多聚鏈間非共價(jià)鍵結(jié)合所形成的聚集體。糖的分子支鏈分支度與多糖的生物活性密切相關(guān)，分支度不同其表現(xiàn)出的生物活性也不同，分支度是植物多糖達(dá)到一定生物活性的關(guān)鍵。此外，多糖的分子質(zhì)量、溶解度、黏度、聚合度、金屬離子絡(luò)合等因素也不同程度影響著植物多糖的生物活性。

2 氧化應(yīng)激產(chǎn)生的原因及其危害

氧化應(yīng)激的產(chǎn)生與細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)氧化物和抗氧化物的失衡有關(guān)。畜禽生產(chǎn)過程中冷熱環(huán)境變化、飼糧改變、飼養(yǎng)管理不完善、疾病等都會引發(fā)機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)自由基的積累，引發(fā)氧化應(yīng)激[2]。細(xì)胞或機(jī)體本身存在抗氧化防御系統(tǒng)，該防御系統(tǒng)可通過增加抗氧化酶的分泌量或提高酶的活性來清除自由基。當(dāng)自由基產(chǎn)生的量過多后，內(nèi)部相應(yīng)抗氧化系統(tǒng)不足以防御，從而引發(fā)了機(jī)體或細(xì)胞的氧化損傷。通常來講，氧化損傷主要從DNA、蛋白質(zhì)、脂肪3個(gè)方面表現(xiàn)，包括DNA的修飾、蛋白羰基化水平及脂質(zhì)氧化變性后丙二醛(MDA)的形成[3-4]。

在不完善的管理?xiàng)l件下，高密度飼養(yǎng)、不良通風(fēng)、缺乏運(yùn)動(dòng)、高能飼糧等因素使得氧化應(yīng)激在動(dòng)物養(yǎng)殖中普遍存在，使機(jī)體免疫力降低，增加腸炎、肺炎、產(chǎn)后敗血癥以及乳腺炎等多種畜禽易患疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。生產(chǎn)中通過添加外源性的抗氧化劑減少飼料中易氧化成分的變質(zhì)，增強(qiáng)機(jī)體抵御氧化應(yīng)激的能力。這類外源性抗氧化劑主要包括維生素類(維生素C、維生素E等)、微量元素(硒、鋅等)，化學(xué)合成抗氧化劑[乙氧基喹啉(EMQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等]以及植物源性抗氧化劑(原花青素、白藜蘆醇等)。由于不能預(yù)估畜牧生產(chǎn)過程中發(fā)生氧化應(yīng)激的程度，并且某些外源抗氧化劑相對較高的價(jià)格，所添加的外源性的抗氧化劑一般是化學(xué)合成抗氧化劑，并且在生產(chǎn)中通常是過量應(yīng)用的，這就會使抗氧化劑在畜禽體內(nèi)形成殘留，影響產(chǎn)品品質(zhì)，污染環(huán)境。因此，尋求一種價(jià)格適宜、綠色無污染的抗氧化劑替代品具有重要意義。

3 植物多糖抗氧化作用的表現(xiàn)

4 植物多糖發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制及主要信號通路

植物多糖參與調(diào)控抗氧化作用的作用機(jī)制主要包含以下2個(gè)方面：其一，植物多糖能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)信號(NF-κB)通路調(diào)節(jié)機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)情況，緩解氧化應(yīng)激帶來的損傷。其二，植物多糖可以通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/Nrf2信號通路促進(jìn)細(xì)胞對Ⅱ相解毒酶的分泌，促進(jìn)抗氧化酶的分泌及活性，降低機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)自由基水平，增強(qiáng)機(jī)體或細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性(圖1)。

Polysaccharides:多糖；TLR：Toll樣受體Toll like receptor；TIR Domain:Toll/白細(xì)胞介素1受體同源結(jié)構(gòu)域 Toll-Interleukin receptor domain；Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid 2-related factor 2；Keap1：Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1；MAPK：絲裂原激活蛋白激酶 mitogen-activated protein kinase；JNK：c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N terminal kinase；ERK:細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 extracellular signal-regulated kinase；P:磷酸化 phosphorylation；Gene Expression:基因表達(dá)；Nucleus：細(xì)胞核；NF-κB:核因子κB nuclear factor κB；MyD88：髓樣分化蛋白88 myeloid differentiation factor 88；IRAK1：白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1 interleukin 1 receptor associated kinase 1；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 tumor necrosis factor receptor-associated factor 6；IKKs：核因子κB抑制激酶 inhibitor of nuclear factor κB kinase；IκBα：核因子κB抑制蛋白α inhibitor α of nuclear factor κB；Degraded：降解；MAVs：線粒體抗病毒信號蛋白mitochondria antiviral signaling protein；RIG-1：維甲酸誘導(dǎo)基因1 retinoic acid inducible gene 1；Ub：泛素化 polyubiquitinated。

圖1植物多糖發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)理

Fig.1 Mechanisms of resisting oxidative stress by plant polysaccharides[9-11]

4.1 NF-κB信號通路

Toll樣受體是先天免疫識別受體家族，能夠誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。包括位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)3、TLR7、TLR8、TLR9，以及位于細(xì)胞膜上的TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6[12]。當(dāng)TLR4被激活后招募髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1(IL-1R associated kinase 1，IRAK1)和腫瘤壞死受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)發(fā)揮胞內(nèi)信號的傳遞[13]。TLR4調(diào)控MAPK和NF-κB 2個(gè)信號元件，并促使NF-κB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游元件的基因表達(dá)[14]。

NF-κB通路是主要的炎性反應(yīng)信號通路，正常情況下是被IκB所抑制的，但是當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，IκB磷酸化、泛素化后降解，釋放NF-κB，使其轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控相關(guān)炎癥因子的基因表達(dá)[15]。植物多糖作用于細(xì)胞之后，與細(xì)胞膜表面Toll樣受體結(jié)合并激活相應(yīng)結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)下游元件的基因表達(dá)。炎癥反應(yīng)的加劇可以導(dǎo)致氧自由基在損傷部位的聚積[16]。炎性因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)和趨化因子IL-8不僅能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，也能開啟和維持細(xì)胞衰老狀態(tài)。其基因表達(dá)受NF-κB的調(diào)控[17]。維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid inducible gene 1，RIG-1)與炎癥相關(guān)，是衰老相關(guān)的炎癥反應(yīng)中的重要信號通路，并且一些慢性炎癥疾病也證明，發(fā)生炎癥反應(yīng)的機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)RIG-1的蛋白表達(dá)上調(diào)。IL-6和IL-8基因的表達(dá)主要是靠NF-κB和激活蛋白1(AP-1)2個(gè)重要元件。在衰老細(xì)胞中，RIG-1調(diào)控NF-κB信號通路，影響IL-6和IL-8基因的表達(dá)[18]。

植物多糖可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)緩解氧化應(yīng)激帶來的損傷，黃芪多糖顯著降低血清中炎癥細(xì)胞因子水平，表現(xiàn)出抗炎作用，緩解嚴(yán)重?zé)齻笫笮募〗M織氧化應(yīng)激所帶來的炎癥損傷[19]，并且黃芪多糖可通過抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚癥[20]。研究顯示，丹參多糖激活NF-κB促使巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞炎性因子的基因表達(dá)，提高細(xì)胞的免疫性能[21]。蒲公英多糖能抑制NF-κB磷酸化緩解氧化損傷[22]。綜合現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞或機(jī)體氧化應(yīng)激出現(xiàn)后，植物多糖能夠通過抑制炎癥因子的基因表達(dá)緩解氧化損傷。而當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，添加植物多糖后，細(xì)胞或機(jī)體通過相關(guān)炎癥信號通路上調(diào)炎癥因子的基因表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫性能。

4.2 MAPK/Nrf2信號通路

MAPK包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的各種刺激進(jìn)行相應(yīng)的應(yīng)答。該通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)和p38 3條內(nèi)部信號通路，ERK在細(xì)胞內(nèi)主要與生長激素及因子的基因表達(dá)相關(guān)，JNK和p38主要是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答氧化應(yīng)激相關(guān)的重要元件[23]。正常情況下，Nrf2與Keap1在胞漿內(nèi)耦連并處于相對抑制的狀態(tài)，當(dāng)該通路被植物多糖激活之后兩者解偶聯(lián)，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相結(jié)合，編碼Ⅱ相解毒酶的基因表達(dá)，以增加細(xì)胞對氧化應(yīng)激的抗性。植物多糖可以通過MAPK信號通路誘導(dǎo)Nrf2通路，調(diào)控Ⅱ相解毒酶的基因表達(dá)[24]。

MAPK/Nrf2信號通路是與氧化應(yīng)激相關(guān)的重要信號通路。植物多糖抗氧化作用的研究對該信號通路研究甚廣。當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，MAPK/Nrf2信號通路被激活，促進(jìn)二相解毒酶血紅素氧合酶1(HO-1)基因的表達(dá)[9]。蒲公英多糖可通過激活MAPK信號通路激活Nrf2誘導(dǎo)HO-1基因的表達(dá)[22]。植物多糖激活MAPK/Nrf2信號通路減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)SOD和GPX等抗氧化酶的合成，增強(qiáng)細(xì)胞或機(jī)體對氧化應(yīng)激的抗性[25]。植物多糖通過MAPK/Nrf2信號通路維持細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡發(fā)揮抗氧化作用。

5 植物多糖抗氧化的應(yīng)用現(xiàn)狀

由于植物多糖抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫的多種生物學(xué)作用，植物多糖對氧化酶的抑制以及對抗氧化酶的激活作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)問題之一，與其相關(guān)研究也日益增多。但植物多糖的作用機(jī)制及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)尚未明確，有關(guān)機(jī)制的研究仍處于探索階段。

TLR4是植物多糖激活的主要細(xì)胞膜受體，近來研究總結(jié)出植物多糖中具有類似結(jié)構(gòu)的植物多糖(TLR4相關(guān)免疫多糖)能夠激活細(xì)胞膜表面TLR4的合成，激活相關(guān)免疫及抗氧化信號通路。這類多糖由半乳糖、鼠李糖、葡萄糖及阿拉伯聚糖等單糖成分組成。紅花多糖[26]、蘋果多糖[27]、當(dāng)歸多糖[28]、黃芪多糖[10]、枸杞多糖[29]中均被證明能被TLR4識別，增強(qiáng)機(jī)體免疫，緩解氧化損傷[30]。

目前研究較多的植物多糖包含黃芪多糖、苜蓿多糖、刺五加多糖以及枸杞多糖等。黃芪是一種補(bǔ)氣血的常用中藥材，具有提高機(jī)體免疫力、抗疲勞的作用。黃芪多糖是黃芪中的主要活性物質(zhì)之一?，F(xiàn)有的研究顯示，黃芪多糖可以抑制因自由基及氧化損傷造成的對線粒體的危害[31]。苜蓿因草質(zhì)優(yōu)良、富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、適應(yīng)能力強(qiáng)及高產(chǎn)量等特點(diǎn)被稱為“牧草之王”。苜蓿多糖是苜蓿草中所提取的重要活性物質(zhì)之一。研究表明，苜蓿多糖具有清除體內(nèi)DPPH·的作用，并且可以提高熱應(yīng)激狀態(tài)下家兔的生產(chǎn)性能及抗氧化能力[32]。而且苜蓿多糖也被證明能能夠減少氧化應(yīng)激對肉雞肝臟細(xì)胞的損傷[33]。刺五加是記錄在《本草綱目》中的典型中草藥，具有治療風(fēng)濕病、高血壓等的作用。研究顯示，刺五加多糖能夠清除DPPH·，提高機(jī)體抗氧化能力[34]。枸杞多糖是具有抗衰老作用，能夠促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移，上調(diào)HO-1基因的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體對氧化應(yīng)激的抗性[35]。

6 小結(jié)與展望

植物多糖是植物提取物中主要活性成分之一，植物多糖對現(xiàn)行所要求的畜禽無抗養(yǎng)殖具有重要實(shí)踐意義。我國中草藥的應(yīng)用已有悠久歷史，而且包括中草藥在內(nèi)的植物資源豐富，研究較多的黃芪多糖、枸杞多糖等均是由中草藥中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的，特別是在糧改飼的大趨勢下，植物多糖應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中的研究具有廣闊前景。

但是，植物多糖的研究處于初步階段，其相關(guān)應(yīng)用仍存在很多問題。首先，植物多糖的提取工藝尚未成熟，尚未形成一套完整嚴(yán)格的體系。其次，植物多糖的提取工藝中使用較多有機(jī)試劑，對提取后多糖飼用的適口性有較大影響，這是否會影響畜禽的采食量還應(yīng)進(jìn)一步探索。第三，提取后的植物多糖濃度不均衡，在畜牧生產(chǎn)中使用的量仍需進(jìn)一步確定。最后，植物多糖中有機(jī)試劑對畜禽機(jī)體是否存在致癌的危害尚不明確，去除有機(jī)試劑是推廣植物多糖目前亟待解決的問題。