動物氨基酸轉(zhuǎn)運與感知系統(tǒng)研究進展

權(quán)素玉 南雪梅* 蔣林樹 熊本海**

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193；2.北京農(nóng)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京102206)

氨基酸是構(gòu)成動物機體最重要的物質(zhì)之一，以各種方式影響著動物的生長發(fā)育。其中，20種L-氨基酸為機體蛋白質(zhì)的合成提供原料，特殊情況下氨基酸也可產(chǎn)生與碳水化合物相當(dāng)?shù)哪芰繛榇蠖鄶?shù)細(xì)胞的代謝提供能量；此外，氨基酸不僅為三羧酸循環(huán)和糖異生提供中間產(chǎn)物，也是許多激素、神經(jīng)遞質(zhì)等合成所需的前體物質(zhì)，在機體特殊物質(zhì)代謝過程，如多胺、肌酸和磷脂酰絲氨酸代謝中發(fā)揮重要作用。因此，機體需要高效的調(diào)節(jié)機制來平衡細(xì)胞內(nèi)外的氨基酸濃度以保證其內(nèi)穩(wěn)態(tài)有條不紊地運行，而氨基酸轉(zhuǎn)運載體在該過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。

Christensen是哺乳動物細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體研究的先驅(qū)，他發(fā)現(xiàn)幾種氨基酸由胞外進入胞內(nèi)時存在競爭關(guān)系，并進一步通過分子克隆證明了氨基酸轉(zhuǎn)運載體的存在[2]。目前，對于機體內(nèi)氨基酸營養(yǎng)代謝相關(guān)的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)通路和一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶(general control nonderepressible kinase，GCN)通路的研究已非常廣泛，但對于氨基酸穿梭細(xì)胞的轉(zhuǎn)運機制及其信號感知的研究甚少，本文綜述了近年來這方面的研究進展，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 氨基酸轉(zhuǎn)運載體的分類

細(xì)胞膜的磷脂雙分子層是一種選擇性屏障，諸如氨基酸這樣的大分子無法擴散穿過，需要跨膜轉(zhuǎn)運載體即跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運載體來協(xié)助其穿梭。氨基酸轉(zhuǎn)運載體在轉(zhuǎn)運氨基酸時會選擇性偶聯(lián)Na+、H+、K+和Cl-的逆向轉(zhuǎn)運。哺乳動物氨基酸轉(zhuǎn)運載體的現(xiàn)代分類方法基于轉(zhuǎn)運載體基因序列的相似性，這種分類方法正在逐漸取代基于“系統(tǒng)”(如功能特性、底物特異性、離子依賴性、pH敏感性、動力學(xué)特性)的傳統(tǒng)分類方法[3]。

哺乳動物氨基酸轉(zhuǎn)運載體的結(jié)合位點通常能夠識別一系列結(jié)構(gòu)相似的氨基酸，按照這種特性氨基酸可分為以下幾類：大中性氨基酸(large neutral amino acids，LNAAs)、小中性氨基酸(small neutral amino acids，SNAAs)、陽離子氨基酸(cationic amino acids，CAAs)和陰離子氨基酸(anionic amino acids，AAAs)[4]。目前存在6種典型的氨基酸轉(zhuǎn)運載體超家族：溶質(zhì)運載蛋白家族(solute carrier family，SLC)成員1(SLC1)、SLC6、SLC7、SLC36、SLC38和SLC43[5]。此外，還包括SLC16，為單羧酸轉(zhuǎn)運載體，能夠轉(zhuǎn)運芳香性氨基酸。這些氨基酸轉(zhuǎn)運載體的典型特點是擁有10～12個跨膜結(jié)構(gòu)域且圍繞著中心孔區(qū)域。SLC3家族雖然也被歸類為氨基酸轉(zhuǎn)運載體，但其結(jié)構(gòu)并不典型，因為它們只有單個跨膜結(jié)構(gòu)域糖蛋白，作為SLC7家族的調(diào)節(jié)亞基發(fā)揮作用[6]。

SLC1家族包括5個高親和力谷氨酰胺(glutamine，Gln)轉(zhuǎn)運載體(SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A6、SLC1A7)和2個中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體(SLC1A4和SLC1A5)。SLC1A5基因編碼丙氨酸(alanine，Ala)-絲氨酸(serine，Ser)-半胱氨酸(cysteine，Cys)轉(zhuǎn)運蛋白2(Ala-Ser-Cys transporter 2，ASCT2)，盡管其命名如此，但其更偏向于轉(zhuǎn)運Gln。ASCT2是選擇性雙向轉(zhuǎn)運載體，Gln、Ser、天冬酰胺(asparagine，Asn)及蘇氨酸(threonine，Thr)可雙向轉(zhuǎn)運，而Ala、纈氨酸(valine，Val)和蛋氨酸(methionine，Met)只能由細(xì)胞外側(cè)向內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運[7]。SLC7家族是重要的Gln轉(zhuǎn)運家族，共有13個成員，分成2個亞群：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運載體(CAA transporter，CATs)和L-氨基酸轉(zhuǎn)運載體(L-amino acid transporter，LATs)。4F2細(xì)胞表面抗原重鏈(4F2 cell-surface antigen heavy chain，4F2hc)是一種多功能蛋白質(zhì)，介導(dǎo)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞激活、生長和黏附，同時又能以與SLC3A2和SLC7A5基因編碼蛋白質(zhì)相結(jié)合的形式形成LAT1/4F2hc異二聚體協(xié)助轉(zhuǎn)運必需氨基酸。LAT2也可與4F2hc共表達(dá)協(xié)同轉(zhuǎn)運氨基酸，其區(qū)別是LAT1/4F2hc復(fù)合體更傾向于轉(zhuǎn)運諸如亮氨酸(leucine，Leu)這樣的LNAAs，而LAT2/4F2hc復(fù)合體底物范圍更寬泛，除LNAAs之外也可轉(zhuǎn)運諸如Ala、甘氨酸(glycine，Gly)這樣的小氨基酸。并且LAT1/4F2hc復(fù)合體對Gln的親和力較低，而LAT2/4F2hc復(fù)合體對Gln的親和力較高[8]。SLC38家族屬于氨基酸多聚胺有機陽離子(amino acid polyamine-organic cation family，APC)家族，該家族共有11個成員，能夠介導(dǎo)Gln、Ala等中性氨基酸及組氨酸(histidine，His)、精氨酸(argnine，Arg)和天冬氨酸(aspartate，Asp)的轉(zhuǎn)運。該家族較被熟知的成員包括SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4及SLC38A5[9]。目前已報道的SLC超家族和具體系統(tǒng)分類本文歸納總結(jié)為表1[3,10]。

表1 SLC超家族及其系統(tǒng)分類

續(xù)表1類型Types系統(tǒng)System氨基酸底物Amino acids substrates蛋白質(zhì)名稱Protein name基因名稱Gene name陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運載體Cationic amino acids transporters y+Arg、LysCAT-1CAT-2CAT-3SLC7A1SLC7A2SLC7A3陰離子氨基酸轉(zhuǎn)運載體Anionic amino acids transporters XA,GGlu、AspEAAT3EAAT2EAAT1SLC1A1SLC1A2SLC1A3

Ala：丙氨酸 alanine；Gly：甘氨酸 glycine；Leu：亮氨酸 leucine；Ile：異亮氨酸 isoleucine；Met：蛋氨酸 methionine；Gln：谷氨酰胺 glutamine；His：組氨酸 histidine；Val：纈氨酸 valine；Ser：絲氨酸 serine；Cys：半胱氨酸 cysteine；Thr：蘇氨酸 threonine；Phe：苯丙氨酸 phenylalanine；Arg：精氨酸 argnine；Asn：天冬酰胺 asparagine；Trp：色氨酸 tryptophan；Lys：賴氨酸 lysine；Glu：谷氨酸 glutamic acid；Asp：天冬氨酸 aspartate；SNAT：血清素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 serotonin N-acetyltransferase；ASCT1：中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體A neutral amino acid transporter A；ASCT2：中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體B neutral amino acid transporter B；ATB0,+：鈉-氯化鈉依賴性中性及堿性氨基酸轉(zhuǎn)運載體 sodium- and chloride-dependent neutral and basic amino acid transporter；B0AT：鈉依賴性中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體 sodium-dependent neutral amino acid transporter；LAT：T細(xì)胞激活鏈接家族成員 linker for activation of T-cells family member；CAT：陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運載體cationic amino acid transporter；EAAT：刺激性氨基酸轉(zhuǎn)運載體 excitatory amino acid transporter；SLC：溶質(zhì)運載蛋白家族成員 solute carrier family member。

2 氨基酸轉(zhuǎn)運載體介導(dǎo)的氨基酸感知信號通路

由氨基酸轉(zhuǎn)運載體介導(dǎo)的氨基酸感知信號通路主要有2種：mTORC1通路和GCN通路。在特定氨基酸高濃度時mTORC1通路激活，mTORC1通路能夠監(jiān)控細(xì)胞質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如溶酶體中的氨基酸濃度[11]。GCN通路主要感知細(xì)胞質(zhì)中與tRNA結(jié)合的氨基酸濃度，GCN2在該過程中發(fā)揮著中心作用[12]。

2.1 mTORC1

mTORC1由3個重要部分構(gòu)成：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、mTOR調(diào)控相關(guān)蛋白(regulatory-associated protein of mTOR，Raptor)及哺乳動物SEC13致死蛋白8(mammalian lethal with SEC13 protein 8，mLST8，又稱GβL)[13]。mTOR作為mTORC1復(fù)合物的中心成分，為Ser-Thr激酶，在調(diào)控細(xì)胞生長、蛋白合成、自噬過程中起中心作用；Raptor促使底物與雷帕霉素靶蛋白信號(target of rapamycin signaling，TOS)基序結(jié)合從而形成mTORC1復(fù)合物；mLST8與蛋白的催化作用相關(guān)，能夠穩(wěn)定激酶激活回路。除這必需的3部分外，mTORC1還含有2個抑制性亞基：富含脯氨酸蛋白激酶1底物1(proline-rich AKT1 substrate 1，PRAS40)和含鄰苯二甲酸二乙酯結(jié)構(gòu)域的mTOR互作蛋白(DEP domain-containing mTOR-interacting protein，DEPTOR)[14]。

mTORC1信號通路與其上游調(diào)節(jié)分子構(gòu)成2條調(diào)控途徑：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)-mTORC1信號通路，肝臟激酶B1(liver kinase B1，LKB1)-腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)-mTORC1信號通路。mTORC1信號通路激活后可通過調(diào)控下游的核糖體蛋白S6激酶β1(p70 S6 kinase β1，S6K1)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白(eIF4E binding protein，4EBP)的磷酸化來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[15]。mTORC1信號通路是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的合成代謝信號機制，對營養(yǎng)水平、生長因子、能量應(yīng)激、組織缺氧刺激產(chǎn)生應(yīng)答[16]。

必需氨基酸，如Leu、色氨酸(tryptophan，Try)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、Arg等能夠激活mTORC1通路[17]。mTORC1對氨基酸濃度的應(yīng)答要通過2種鳥苷三磷酸酶(GTPase)介導(dǎo)：Rag GTPase和腦內(nèi)富含的Ras同源GTPase(Ras homolog enriched in brain GTPase，Rheb GTPase)[18]。氨基酸激活mTORC1通路必須通過溶酶體膜G-蛋白和Rheb GTPase來介導(dǎo)，Rheb GTPase通過下游結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)起作用，正向調(diào)節(jié)mTORC1信號通路[19]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了一些與mTORC1信號通路相關(guān)的氨基酸胞內(nèi)感受器，如Leu tRNA合成酶(LRS)、谷氨酸脫氫酶(GDP)、支鏈氨基酸受體1等[11]。LRS對胞內(nèi)Leu濃度非常敏感，通過移位至溶酶體促進核苷與Rag GTPase結(jié)合進而激活mTORC1通路[20]。液泡膜H+-腺苷三磷酸酶(ATPase)存在于溶酶體膜，對氨基酸累積非常敏感，可直接作用于Rag GTPase激活mTORC1信號通路，是近年來新發(fā)現(xiàn)的重要胞內(nèi)氨基酸感受器[21]。

Kim等[22]研究顯示，胰高血糖素選擇性封閉可增加中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC38A5的表達(dá)，后者通過mTORC1信號通路調(diào)控小鼠胰腺α細(xì)胞的增殖。Pinilla等[23]研究顯示，在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中，慢性競爭性抑制氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC38A2能夠降低細(xì)胞中SLC38A2底物氨基酸及必需支鏈氨基酸的濃度，使mTORC1依賴性S6K1磷酸化水平增加。Nicklin等[24]研究顯示，氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLA1A5和SLC7A5受到抑制后，HeLa細(xì)胞通過限制Gln和Leu的吸收抑制mTORC1通路激活。

2.2 GCN

GCN2屬于真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)激酶，能夠通過直接結(jié)合未負(fù)荷空載tRNAs感知細(xì)胞內(nèi)特定的氨基酸缺乏。eIF2α磷酸化后可破壞Met起始密碼子，從而阻止mRNA翻譯起始，降低球蛋白的合成。氨基酸饑餓后這一反應(yīng)便于mRNA選擇性翻譯蛋白質(zhì)合成、修飾及清除相關(guān)基因[7]。許多細(xì)胞中，GCN信號通路的重要作用就是在氨基酸缺乏時上調(diào)氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC38A2的基因表達(dá)，這一過程被稱為“適應(yīng)性調(diào)節(jié)”，涉及如下幾個過程：轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcription actor，ATF4)結(jié)合于SLC38A2氨基酸反應(yīng)元件激活轉(zhuǎn)錄，通過內(nèi)部核糖體進入位點維持SLC38A2 mRNA翻譯和增加SLC38A2的穩(wěn)定性(減少其降解)[25]。在GCN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，氨基酸轉(zhuǎn)運載體既起到了“轉(zhuǎn)運子(transporter)”的作用，又起到了“感受體(receptor)”的作用，像這種兼具轉(zhuǎn)運和信號感知功能的載體被稱為“transceptors”。目前已明確的“transceptors”包括SLC38A2和SLC36A1，它們能夠感知氨基酸的豐度而不依賴于其轉(zhuǎn)運功能[26]。

3 氨基酸轉(zhuǎn)運載體與氨基酸感知的組織特異性

近年來，氨基酸轉(zhuǎn)運載體在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成中的研究日趨增多。細(xì)胞內(nèi)可用氨基酸濃度感知、mTORC1信號通路激活、蛋白質(zhì)合成機制正在逐漸被人們所了解，同時，多種氨基酸轉(zhuǎn)運載體及其感受器在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)和定位已被研究和揭示。

3.1 骨骼肌的氨基酸轉(zhuǎn)運及感知

研究發(fā)現(xiàn)，人類骨骼肌氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達(dá)是動態(tài)的，可對多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答，表明其對人類骨骼肌的適應(yīng)性有獨特的調(diào)節(jié)作用，更好地了解其作用機制有利于我們優(yōu)化營養(yǎng)策略，改善骨骼肌健康。

研究顯示，老人抗阻訓(xùn)練后骨骼肌注射氨基酸，其特定的氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達(dá)增加[27]。給健康的年輕人注射氨基酸，其骨骼肌細(xì)胞中氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC7A5、SLC38A2和SLC36A1的mRNA表達(dá)顯著增加[28]。骨骼肌注射氨基酸，隨后氨基酸逐漸恢復(fù)至正常水平，蛋白質(zhì)表達(dá)增加仍可持續(xù)2～3 h[29]。在動物和人類骨骼肌中，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的有效性主要通過mTORC1信號通路調(diào)節(jié)，mTORC1信號通路激活可促進骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，減弱自噬[30]。最近研究顯示，氨基酸轉(zhuǎn)運載體對骨骼肌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氨基酸濃度變化有整體作用，它既在氨基酸向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中起中心作用，又通過“transceptors”感知細(xì)胞外氨基酸狀況[31]。肌肉組織特異性敲除SLC7A5的小鼠飼喂高蛋白質(zhì)飼糧后表現(xiàn)出輕微胰島素抵抗，并伴有mTORC1信號通路激活[32]。

3.2 上皮細(xì)胞的氨基酸轉(zhuǎn)運及感知

1985年，Baumrucker[33]初步闡明了奶牛乳腺組織中氨基酸的功能特性。必需氨基酸，尤其是Leu，在乳蛋白合成過程中起著重要的調(diào)控作用。Leu主要通過L轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入胞內(nèi)，如LAT1(SLC7A5)偶聯(lián)CD98(SLC3A2)、LAT3(SLC7A7)及y+系統(tǒng)的LAT3(SLC43A1)，其中，LAT1常用來研究氨基酸依賴性mTORC1信號通路激活[34]。由于LAT1將Leu轉(zhuǎn)運入細(xì)胞的同時，需要反向轉(zhuǎn)運Gln，所以中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT2(SLC1A5)、SNAT2(SLC38A2)及SNAT4(SLC38A4)先于Leu將Gln轉(zhuǎn)運入細(xì)胞是Leu跨膜轉(zhuǎn)運的先決條件[35]。Moshel等[36]研究發(fā)現(xiàn)，除去奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的所有氨基酸或選擇性除去培養(yǎng)基中的Leu可降低mTORC1信號通路介導(dǎo)的乳蛋白和β-乳球蛋白的表達(dá)。氨基酸供應(yīng)增加后，刺激鳥苷二磷酸轉(zhuǎn)變，鳥苷三磷酸定位在Rag異二聚體上，然后與mTORC1結(jié)合后移位至溶酶體膜，進一步發(fā)揮作用[37]。Leu供應(yīng)可影響乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白的合成[38]，且包括Leu在內(nèi)的多種氨基酸混合添加可促進mTORC1信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化[39]。

特定的氨基酸轉(zhuǎn)運載體不僅能夠跨膜運輸氨基酸，而且這些氨基酸轉(zhuǎn)運載體能夠通過mTORC1信號通路影響蛋白質(zhì)的合成[40]。Drummond等[41]研究發(fā)現(xiàn)，必需氨基酸增加可上調(diào)LAT1、CD98、Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC38A2的基因表達(dá)，并通過mTORC1信號通路使蛋白質(zhì)合成代謝增強。抑制特定氨基酸轉(zhuǎn)運載體的活性，同時增加氨基酸濃度，mTORC1信號通路非但沒有激活，反而被抑制[24]。Li等[42]研究顯示，最佳比率的必需氨基酸供給可通過mTORC1信號通路刺激乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的合成。Gao等[43]研究發(fā)現(xiàn)，單一添加不同濃度Leu或His可通過mTORC1信號通路調(diào)控乳蛋白的合成。

除乳腺上皮細(xì)胞外，其他組織器官的上皮細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體也可激活mTORC1信號通路。Na+偶聯(lián)的中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC6A19基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的腸上皮及腎上皮細(xì)胞氨基酸饑餓癥狀[44]。以中性氨基酸和CAAs為底物的Na+/Cl-偶聯(lián)氨基酸轉(zhuǎn)運載體SLC6A14在哺乳動物囊胚時期顯著上調(diào)，其能為胚泡的激活和滋養(yǎng)層的生長提供足夠的氨基酸，尤其是Leu[45]。胎盤的生長受到mTORC1信號通路的調(diào)控，后者能夠影響氨基酸轉(zhuǎn)運載體的翻譯后修飾或其在胎盤表面的移位[46]。

4 小 結(jié)

氨基酸轉(zhuǎn)運載體在哺乳動物細(xì)胞生長和代謝過程中發(fā)揮重要作用，可通過mTORC1信號通路和GCN信號通路調(diào)節(jié)機體的營養(yǎng)平衡。體外細(xì)胞試驗為我們提供了氨基酸感知的分子基礎(chǔ)，但研究者通常是在培養(yǎng)基中添加2～5倍體內(nèi)細(xì)胞液濃度的氨基酸混合物，或者是在氨基酸饑餓處理后添加氨基酸混合物來研究mTORC1信號通路的激活，與動物機體真實的代謝情況存在一定偏差，需未來工作者進一步的研究與完善。