三黃雞免疫重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗血清抗體檢測試驗報告

禽流感（avian influenza，AI）是禽流感病毒（AIV）感染家禽后引起的各種綜合征，從無臨床癥狀感染到呼吸道疾病和產蛋下降，到死亡率接近100%的嚴重全身性疾病不等。根據(jù)禽流感病毒的致病性和毒力的不同，可將其分為高致病性禽流感（HPAI），低致病性禽流感（LMPAI）。高致病性禽流感可導致嚴重的家禽群體發(fā)病和死亡，不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅型的打擊，還可以不斷地跨種間傳播感染人類，人感染后死亡率高達60%。其中H5N1與H7N9就是近年兩種常見人禽共患禽流感病毒亞型。且H7N9流感病毒已由原來的對禽的低致病性變異為高致病性，自2016年12月～2017年5月，兩廣地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)式禽流感H7N9疫情，并且多地有人感染H7N9的報道。我國決定從2017年秋季起，在家禽全面免疫禽流感H5的基礎上，逐步全面開展H7N9免疫。為了解重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活苗免疫在不同地區(qū)不同養(yǎng)殖場的免疫效果，本試驗團隊于2017年10月，在賀州市隨機選取了4個三黃雞養(yǎng)殖場開展了疫苗免疫與血清抗體檢測試驗。本試驗的完成不僅可以了解賀州市不同地區(qū)三黃雞養(yǎng)殖場的H5及H7亞型禽流感抗體水平，還可以根據(jù)檢測結果，了解抗體消長規(guī)律，指導養(yǎng)殖場制定合理的免疫程序，為有效的防控禽流感的發(fā)生與流行提供參考依據(jù)。

一、材料與方法

1.試驗雞群。在賀州市選擇4家飼養(yǎng)水平良好的三黃雞規(guī)?；B(yǎng)殖場，分別標記為A場、B場、C場、D場，全部采用全進全出養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖規(guī)模為9000-27000只。

2.試驗疫苗。重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活疫苗，簡稱（H5+H7）二價滅活苗（下同），為國內某廠家生產，生產批號為：2017103。

3.檢測試劑。禽流感H5亞型、H7亞型血凝抑制（HI）試驗抗原及標準陽性血清購自哈爾濱維科生物技術有限責任公司。雞紅細胞混懸液（1%）及磷酸鹽緩沖液（PBS）由本實驗室自行配制。

4.試驗分組與采樣。A、B、C、D四家養(yǎng)殖場雞只均在60日齡時進行第一次免疫，一免后第21 d進行第二次免疫，兩次免疫的免疫劑量均為0.5 ml/羽，采取頸部皮下注射進行免疫接種。各場分別在免疫后第0 d、第15 d、第30 d、第45 d、第60 d隨機選擇60只雞，翅靜脈采血2 ml/羽，分離血清后-20℃保存，統(tǒng)一檢測。

5.抗體測定。檢測方法及結果判定參照GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術進行。

二、結果與分析

1.H5亞型血清抗體檢測結果。1500份血清樣品的H5亞型血清抗體檢測結果見表1和圖1。結果表明：該疫苗免疫三黃雞后，可較好的刺激機體產生H5 HI抗體，且四個場的HI抗體消長規(guī)律基本一致，其平均抗體水平均呈現(xiàn)隨日齡增加先上升后下降再平穩(wěn)回升的明顯變化。一免后H5 HI抗體迅速上升，在一免后第15 d時，四個場的抗體均可達到平均抗體滴度5.0 log2以上的合格水平。加強免疫后（一免后第21 d），H5 HI抗體迅速升高，該疫苗在加強免疫后第9 d（一免后第30 d）H5 HI抗體水平達到高峰，此時A、B、C、D四個場的H5 HI抗體滴度分別為9.27 log2、6.88 log2、8.15 log2、9.10 log2；到加強免疫后第39 d（一免后第60 d）H5 HI的抗體水平均保持在6.0 log2以上。此外，在一免后第15～60 d期間四個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于80%。

表1 H5亞型血清抗體的檢測結果

圖1 不同日齡H5亞型血清抗體平均值的變化曲線

2.H7亞型血清抗體檢測結果。1500份血清樣品的H7亞型血清抗體檢測結果見表2和圖2。結果表明：該疫苗免疫三黃雞后，可較好的刺激機體產生H7 HI抗體，且四個場的HI抗體消長規(guī)律基本一致，其平均抗體水平均呈現(xiàn)隨日齡增加先上升后下降再平穩(wěn)回升的明顯變化。一免后H7 HI抗體迅速上升，在一免后第15 d時，四個場的平均抗體滴度最高可達到7.03 log2。加強免疫后（一免后第21 d），H7 HI抗體迅速升高，該疫苗在加強免疫后第9 d（一免后第30 d）H7 HI抗體水平達到高峰，此時A、B、C、D四個場的H7 HI抗體滴度分別為8.93 log2、6.22 log2、8.28 log2、9.20 log2；到加強免疫后第 39 d（一免后第60 d）H7 HI的抗體水平均保持在4.5 log2以上的合格水平。此外，在一免后第30～60 d期間四個養(yǎng)殖場的抗體陽性率均高于80%。

表2 H7亞型血清抗體的檢測結果

圖2 不同日齡H7亞型血清抗體平均值的變化曲線

三、小結與討論

1.禽流感H5亞型血清抗體消長規(guī)律。對檢測結果的分析表明，一免后第0 d H5抗體平均水平為0，說明在雞60日齡時母源抗體已經(jīng)消失。此時對幼雞進行第一次免疫，21 d后進行第二次免疫，注射疫苗后逐漸誘導機體產生抗體。一免后第15 d抗體滴度快速上升，加強免疫后第9 d（一免后第30 d）抗體水平持續(xù)上升，但上升速率有所下降。第45 d抗體平均水平降至最低，說明一免產生的抗體水平開始下降，二免誘導產生的抗體上升速度不及下降速度。第60 d抗體水平已表現(xiàn)回升，說明二免后產生的抗體上升速度超過了一免產生的抗體的下降速度，家禽總體抗體水平升高，達到保護狀態(tài)。

從結果來看，一免后第15 d至肉雞出欄(第60 d)的時間段內，家禽抗體滴度均達到合格標準，說明該免疫程序可有效抵抗禽流感H5亞型病毒的入侵。

2.禽流感H7亞型血清抗體消長規(guī)律。檢測結果顯示，一免后0 d時H7抗體平均水平為0，說明此時母源抗體已經(jīng)消失。此時對幼雞進行第一次免疫，21 d后進行第二次免疫，注射疫苗后逐漸誘導機體產生抗體。第15 d抗體迅速升高，第30 d4個場的抗體水表現(xiàn)為持續(xù)快速上升，抗體平均滴度已經(jīng)達到6 log2以上，最高為9.2 log2的較高水平。加強免疫后第24 d（一免后第45 d）抗體水平下降至最低，可見二免產生的抗體上升速度還未及一免后產生的抗體下降的速度。第60 d B、C、D場均表現(xiàn)為回升，表明一免產生的抗體持續(xù)下降，二免后產生的抗體逐漸上升至較高水平，可使機體繼續(xù)保持較高的抗體效價，產生有效的抗體保護。

3.H5+H7二價滅活疫苗的免疫探討。

（1）免疫方案的分析。使用該疫苗一免后第15 d時機體H5、H7抗體水平均明顯上升，第15～30 d時抗體上升緩慢，第30 d（90日齡）后抗體開始下降。若沒有進行第二次免疫，抗體水平持續(xù)下降，在出欄前（120日齡）出現(xiàn)疫情的幾率和風險較高。二免后，機體第二次誘導產生的抗體逐漸升高，使得抗體水平停止下降甚至有所升高，在出欄前得到有效的抗體保護。因此，對肉雞進行禽流感二次免疫是必要的；

（2）疫苗的應用推廣。此疫苗在三黃雞中對H5、H7均可產生較高的抗體水平，證明免疫效果確實。禽流感病毒既在家養(yǎng)禽類和野生禽類之間相互傳播，又隨候鳥遷徙，將病毒帶到世界各個角落。對于這種傳播迅速的疫情，H5+H7二價滅活疫苗應列入強制免疫計劃，由試點到全國應用，加強商品禽和種禽的免疫，切實做好生物安全防護等多方面的防控工作。

（3） H5+H7二價滅活疫苗的優(yōu)點。重組禽流感病毒(H5+H7)二價滅活苗屬于全病毒滅活疫苗，具有制備工藝簡單，免疫效果及安全性好、免疫持續(xù)時間長且不會出現(xiàn)毒力返強和變異的優(yōu)點。選擇二價苗可以減少免疫次數(shù)，提高免疫效率；

（4）存在問題。試驗免疫程序首免日齡選擇在60日齡，此時雞只體內H5及H7抗體均為零。而本試驗未了解幼雞母源抗體的變化，在幼雞母源抗體最低值時到進行第一次免疫后產生合格抗體水平的時間段內是否處于保護狀態(tài)未知，因此免疫程序還有待優(yōu)化。同樣在不同的地域，品種不一致的情況下，合理的選擇首免日齡，免疫劑量，免疫方案都是值得研究探討的內容。

參考文獻（略）