兩種方法檢測(cè)豬O型口蹄疫免疫抗體的對(duì)比試驗(yàn)

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種烈性、急性、熱性、接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須報(bào)告的傳染病。在世界上許多國(guó)家或地區(qū)都有發(fā)生和流行，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)行業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)通過(guò)實(shí)施強(qiáng)制免疫來(lái)防控該病，而免疫后產(chǎn)生的抗體水平是評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量和免疫效果的重要手段，也是制定合理免疫程序的科學(xué)依據(jù)。但在實(shí)際檢測(cè)中，常因抗體檢測(cè)方法不同而使結(jié)果存在一定偏差，同一份樣品采用不同的方法得出不同的判定結(jié)果也偶有出現(xiàn)，因此選擇科學(xué)合理的檢測(cè)方法，是進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)免疫質(zhì)量的基礎(chǔ)。因此，本檢測(cè)室使用口蹄疫病毒 VP1 結(jié)構(gòu)蛋白抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒和口蹄疫液相阻斷ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)口蹄疫O型免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)并作對(duì)比分析。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)是應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)法的模型將抗原包被，用HRP-抗體與樣本一起加入。樣本中的Ag與Solid-Ag競(jìng)爭(zhēng)HRP-Ab，固相吸附的HRP-Ab與樣本中的Ag濃度成反比。本法使將小分子抗原包被在酶標(biāo)板上，檢測(cè)時(shí)加入待測(cè)樣本，使樣本中的待測(cè)抗體與酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合。然后加入HRP酶標(biāo)記的抗體，此抗體也可與酶標(biāo)板上的抗體結(jié)合，由于酶標(biāo)板上固定了一定數(shù)量的抗原，因此當(dāng)樣本中抗體的量越多，則HRP酶標(biāo)記抗體可結(jié)合的包被抗原就越少，兩種抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗體，所以為競(jìng)爭(zhēng)法。

液相阻斷ELISA 抗體檢測(cè)是應(yīng)用雙抗體夾心法的模型，針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。適用于測(cè)定大分子抗原及對(duì)應(yīng)的抗體，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原及對(duì)應(yīng)的抗體，因?yàn)樗荒苄纬蓛晌稽c(diǎn)夾心。ELISA是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，過(guò)程包括抗原（抗體）吸附在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體（抗原），再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原），生成抗原（抗體）-待測(cè)抗體（抗原）-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物發(fā)生有色反應(yīng)。最終通過(guò)酶標(biāo)儀的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)器材。單道、12道移液器若干、96孔U型反應(yīng)板若干、37℃恒溫生化培養(yǎng)箱、100 ml量筒、iMark-酶標(biāo)儀。

2.血清樣品。隨機(jī)采集進(jìn)行了豬口蹄疫O型滅活疫苗二次免疫后約40 d的95～120日齡育肥血液樣品48份，分離血清，放置4℃冰箱保存待測(cè)。

二、診斷試劑

口蹄疫抗體O型競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒為科研單位提供的試驗(yàn)用品，口蹄疫O型液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所診斷中心，批號(hào)為20171205101-5。

三、檢測(cè)方法及結(jié)果判定

1.口蹄疫抗體O型競(jìng)爭(zhēng)ELISA。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算兩孔的平均OD值后乘以0.6，該值即為臨界值，表示阻斷40%反應(yīng)的對(duì)照OD值。待測(cè)樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待測(cè)樣品OD值 臨界值判為陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該樣品的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)＞1∶16判定為抗體合格。

2.口蹄疫抗體O型液相阻斷ELISA。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算兩孔的平均OD值后乘以0.5，該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對(duì)照OD值。待測(cè)樣品OD值＞臨界值，判為陰性孔；待測(cè)樣品OD值≦臨界值判為陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔的最高稀釋倍數(shù)即為該樣品的抗體效價(jià)，豬血清抗體效價(jià)≧1∶64判定為抗體合格；牛血清抗體效價(jià)≧1∶128判定為抗體合格。

四、結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)分析，競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)豬血清O型合格率為91.7%；液相ELISA檢測(cè)豬血清O型合格率也為91.7%。兩種方法檢測(cè)豬血清O型抗體合格率符合度均為100%。

從檢測(cè)抗體效價(jià)的整體結(jié)果來(lái)看，兩種方法測(cè)得的抗體效價(jià)不存在明顯的相關(guān)性，但當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得的抗體效價(jià)≧1∶180時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)ELISA與液相ELISA的抗體效價(jià)為1∶2的關(guān)系；由于競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)得的抗體效價(jià)≧1∶180的樣品只有5份，若要證實(shí)此觀點(diǎn)，還需更多的檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)支撐。

表1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA與液相ELISA檢測(cè)豬O型口蹄疫免疫抗體結(jié)果

表2 豬血清樣品抗體檢測(cè)效價(jià)

(續(xù)表)

五、分析與討論

檢測(cè)結(jié)果顯示，競(jìng)爭(zhēng)ELISA與液相ELISA兩種檢測(cè)方法的抗體合格率完全符合，檢測(cè)同一血清的抗體效價(jià)并無(wú)明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系，兩種檢測(cè)方法均有較高的敏感性和特異性，試驗(yàn)方法科學(xué)合理，試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠。

檢測(cè)結(jié)果中競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法明顯低于液相ELISA方法檢測(cè)樣品的抗體效價(jià)，可能是競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法使用口蹄疫病毒 VP1結(jié)構(gòu)蛋白作為結(jié)合抗原，而液相ELISA使用口蹄疫全病毒作為結(jié)合抗原，全病毒含有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，相比競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法反應(yīng)程度更強(qiáng)。但隨著稀釋滴度的增加，抗原抗體反應(yīng)特異性更加明顯，受客觀客觀因素的影響會(huì)越來(lái)越小，兩種方法測(cè)得的抗體效價(jià)對(duì)應(yīng)關(guān)系趨于穩(wěn)定。

兩種方法都通過(guò)儀器設(shè)備判定結(jié)果，無(wú)人為因素干擾，這樣會(huì)大大提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。相比競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，液相ELISA操作步驟繁多，試驗(yàn)所需時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)要求檢測(cè)人員技術(shù)熟練，要求技術(shù)評(píng)估人員有較強(qiáng)的數(shù)據(jù)綜合分析能力。

我國(guó)各省市、區(qū)縣每年都要投入大量的資金來(lái)支持重大動(dòng)物疫病防控免疫效果的評(píng)估工作，但檢測(cè)結(jié)果常因疫苗來(lái)源的不同、檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑不一致造成一定的偏差，尤其是在樣本較少的情況下，檢測(cè)結(jié)果的差異化更加明顯。所以，筆者認(rèn)為通過(guò)運(yùn)用不同方法進(jìn)行試驗(yàn)比對(duì)，探索出一套免疫抗體監(jiān)測(cè)體系，能夠更客觀的評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量，更全面的評(píng)估疫苗免疫效果及免疫效力，為疫苗用戶提供更為優(yōu)質(zhì)化的技術(shù)服務(wù)。