黃芩苷對(duì)大鼠放射性肺損傷的保護(hù)作用

何志堅(jiān) 勝海峰 劉海云

隨著人們生活水平的提高，惡性腫瘤的發(fā)病率也越來(lái)越高，其中胸部惡性腫瘤發(fā)病率排名居首。除了手術(shù)，放射治療是胸部惡性腫瘤的重要治療手段之一。但在放療過(guò)程中不可避免的會(huì)造成肺部損傷，所以放射性肺損傷是胸部放療最常見(jiàn)的并發(fā)癥，給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)了嚴(yán)重影響，同時(shí)還限制了臨床醫(yī)生對(duì)腫瘤放射劑量的使用，影響疾病的療效[1-2]。目前臨床上放射性肺損傷的治療多以激素治療為主，但用藥時(shí)間長(zhǎng)，副作用多且效果欠佳，因此尋求1種有效且副作用少的理想藥物是當(dāng)今放射性肺損傷的研究熱點(diǎn)之一[3]。國(guó)內(nèi)外大量研究證明，中醫(yī)藥治療對(duì)放射性肺損傷有比較好的療效及較低的毒副作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)建立放射性肺損傷大鼠模型，觀察中藥黃芩苷對(duì)放射性肺損傷大鼠血漿TNF-α、TGF-β1，IL-1含量的影響，研究黃芩苷防治放射性肺損傷的效果并探討其可能的作用機(jī)理，進(jìn)一步為臨床的治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠144只，體重(200±20)g，大鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雄性，許可證號(hào)SYXK(贛)2017-0023。室溫20 ℃～22 ℃，相對(duì)濕度40%～67%，空氣新鮮，通風(fēng)良好，大鼠分籠固體飼料喂養(yǎng)，自由飲水，正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)飼養(yǎng)4天左右，無(wú)異常者納入分組實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

黃芩苷(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：C22J7Y9309)；地塞米松(河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H13021677，規(guī)格：5 mg/支)；脂多糖(LPS)(北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格：10 mg/瓶，批號(hào)：1020K032)；白細(xì)胞介素1(IL-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均購(gòu)于武漢博士得生物工程有限公司，編號(hào)分別為 EK0745，EK0527，EK0465；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

微量進(jìn)樣器(德國(guó)eppendorf公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)，AdventurerTM電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)，TGL-16G型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，TECAN酶標(biāo)儀sunrise(奧地利TECAN公司) EL3Olsrip Reader 酶標(biāo)儀(均為美國(guó)Bio Tek 公司) ，顯微鏡(Motic麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，6MV-X 線(xiàn)直線(xiàn)加速器(山東新華醫(yī)療器械有限公司)；550 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.4 藥物濃度配制

根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》記載方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥量，根據(jù)成人的臨床用量，按大鼠的等效劑量折算系數(shù)，換算為大鼠給藥量，地塞米松大鼠用藥劑量為5 mg·kg-1，黃芩苷用藥劑量分別為50、100、200 mg·kg-1。用無(wú)菌生理鹽水(0.9%氯化鈉注射液)溶解，攪拌均勻，每次實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配，每天1次，連續(xù)7天。

1.5 分組及給藥

144只雄性SD大鼠隨機(jī)分成6組，正常對(duì)照組、模型組(單純照射組)、激素(地塞米松)組、中藥黃芩苷低、中、高劑量(50、100、200 mg·kg-1)組，每組24只，除正常對(duì)照組，其余各組均要進(jìn)行X線(xiàn)照射，照射前3天至照射后第28天對(duì)大鼠行腹腔注射處理，其中黃芩苷和地塞米松用無(wú)菌生理鹽水混勻，按5 mL·kg-1給藥體積進(jìn)行腹腔注射，正常對(duì)照組及單純照射模型組注射相同體積的生理鹽水。第4周以后所有組均給相同體積的生理鹽水直至取材。每組分別在第2、4、8、12周各處死6只大鼠，取標(biāo)本備用。

1.6 動(dòng)物造模[4]

造模大鼠選用10%的水合氯醛，按3 mL/kg腹腔注射麻醉，按一定順序仰臥于照射臺(tái)上，調(diào)整好照射視野，上至大鼠前肢兩腋窩中點(diǎn)連線(xiàn)，下至劍突水平，照射面積為4.5 cm×4 cm。除正常組假裝照射外，其他各組都用直線(xiàn)加速器6MV-X線(xiàn)進(jìn)行全肺單次照射(照距SSD為100 cm)，劑量300 cGy/min，總劑量為20 Gy，照射前紫外線(xiàn)照射消毒。

1.7 標(biāo)本留取

各組大鼠分別于首次照射結(jié)束后第2、4、8、12周末次給藥后禁食6 h，隨機(jī)抽取6只大鼠，稱(chēng)重，根據(jù)體重用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉; 隨后將大鼠固定，仰臥位，手術(shù)刀切開(kāi)皮膚打開(kāi)胸腔并暴露其心臟，隨即進(jìn)行心臟取血5 ml，把血分裝在離心管中，室溫靜置1 h，離心機(jī)離心(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)10 min后，微量加樣器吸取上清液，分裝入EP管中置于-80 ℃冰箱凍存，備用。取血完畢后，迅速摘取右肺組織，置于10%甲醛溶液固定，備用。

1.8 血清指標(biāo)檢測(cè)

取備用血清采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)法，檢測(cè)TNF-α、IL-1、TGF-β1因子濃度，具體操作方法按照試劑盒里詳細(xì)的說(shuō)明進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況的觀察

正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)好，活潑愛(ài)動(dòng)，飲食正常，皮毛光澤；模型組(單純照射組)大鼠精神萎靡，活動(dòng)減弱，進(jìn)食減少，皮毛顏色變暗無(wú)光澤，活動(dòng)則喘。黃芩苷和地塞米松給藥組精神和活動(dòng)度尚可，飲食由開(kāi)始差逐漸好轉(zhuǎn)，均無(wú)大鼠死亡現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TNF-a含量的變化

與正常對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠血清TNF-a含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4周和第8周達(dá)到高峰，第12周開(kāi)始下降。與模型組比較，黃芩苷中、高劑量給藥組和地塞米松治療組大鼠血清TNF-a含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TNF-a含量的變化

注：與正常對(duì)照組比較，①為P<0.05；與衰老模型組相比，②為P<0.05。

2.3 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1含量的變化

與正常對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠血清TGF-β1含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4周和第8周達(dá)到高峰，第12周開(kāi)始下降。與模型組比較，黃芩苷中高劑量給藥組和地塞米松治療組大鼠血清TGF-β1含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1含量

注：與正常對(duì)照組比較，①為P<0.05；與衰老模型組相比，②為P<0.05。

2.4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清IL-1含量的變化

與正常對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠血清IL-1含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，第4周和第8周達(dá)到高峰，第12周開(kāi)始下降。與模型組比較，黃芩苷中、高劑量給藥組和地塞米松治療組大鼠血清IL-1含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清 IL-1含量

注：與正常對(duì)照組比較，①為P<0.05；與衰老模型組相比，②為P<0.05。

3 討論

黃芩是唇形科草本植物(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根，黃芩主要生長(zhǎng)在我國(guó)的北方，如河北、河南、山東、內(nèi)蒙古、陜西、東北等地；在韓國(guó)，日本也有發(fā)現(xiàn)。黃芩苷是黃芩中的有效成分之一，是一種黃酮類(lèi)化合物，具有多種藥理作用，如抗菌、消炎、降壓、保肝、利膽等多種作用[5]。常用于治療一些感染性疾病。研究發(fā)現(xiàn)黃芩水提物對(duì)脂多糖造成的急性肺損傷有一定的保護(hù)作用[6]。本實(shí)驗(yàn)是研究黃芩苷對(duì)放射性肺損傷的防治研究。

胸部腫瘤在放療的過(guò)程中，很容易發(fā)生放射性肺損傷，其最常見(jiàn)的兩種形式是放射性肺炎與放射性肺纖維化。放射性肺炎一般發(fā)生在第1～3個(gè)月，繼而再發(fā)生肺纖維化。如果患者一旦發(fā)生肺纖維化就是不可逆轉(zhuǎn)的，治療效果就會(huì)比較差[7]。因此，在對(duì)患者進(jìn)行放療的同時(shí)，還應(yīng)使用藥物進(jìn)行干預(yù)治療，以降低放射性肺損傷的發(fā)生。放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)理還未完全清楚，其中細(xì)胞因子學(xué)說(shuō)是造成放射性肺損傷的主要假說(shuō)之一。放射性肺損傷的早期表現(xiàn)為肺泡內(nèi)大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，隨后引起大量炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放[8]，如TGF-β1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子在放射性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

TNF-α與早期放射性肺損傷關(guān)系密切，有非常強(qiáng)的局部促炎性反應(yīng)作用，和白細(xì)胞介素IL-1等被統(tǒng)稱(chēng)為前炎癥細(xì)胞因子，主要通過(guò)改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，刺激中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的滲出，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與正常對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠血清TNF-a含量顯著升高，第4周和第8周達(dá)到高峰，第12周開(kāi)始下降。說(shuō)明血清中TNF-a對(duì)早期放射性肺損傷比較敏感，與模型組比較，黃芩苷中高劑量給藥組和地塞米松治療組大鼠血清TNF-a含量均顯著降低。說(shuō)明黃芩苷可以降低血清中TNF-a的含量，對(duì)放射性肺損傷有一定的防治作用。

TGF-β1是放射性肺損傷比較公認(rèn)的的預(yù)測(cè)因子[9]，是一種多功能的重要前炎性因子，可以增加中性粒細(xì)胞分泌多種炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步擴(kuò)大其生物效應(yīng)，加速肺損傷的發(fā)生發(fā)展，TGF-β1含量升高被認(rèn)為是放射性肺損傷的標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷可以降低血清中TGF-β1的含量，對(duì)放射性肺損傷起到一定的保護(hù)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠放射性肺損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察了中藥黃芩苷在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠放射性肺損傷的防治作用，研究結(jié)果表明放射性肺損傷模型組促炎性因子TGF-β1、IL-6和TNF-α明顯升高，而中藥黃芩苷干預(yù)后明顯降低了血清中TGF-β1、IL-6和TNF-α的含量，證明中藥黃芩苷對(duì)促炎性因子具有一定的抑制作用，對(duì)放射性肺損傷具有一定的保護(hù)作用，在一定程度上能減輕了肺損傷。