電針對(duì)腰椎間盤突出癥模型大鼠脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路的影響

林元杰,張峻峰,康學(xué)智,鄭明岳,王春曉,吳耀持

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電針對(duì)腰椎間盤突出癥模型大鼠脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路的影響

林元杰,張峻峰,康學(xué)智,鄭明岳,王春曉,吳耀持

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院,上海 200233)

觀察電針對(duì)腰椎間盤突出癥大鼠的干預(yù)效應(yīng)及對(duì)脊髓JAK激酶2(JAK2)-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路的影響。將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組,每組12只。采用自體髓核移植建立大鼠腰椎間盤突出模型。電針組取右側(cè)腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽(yáng)陵泉進(jìn)行電針治療。觀察各組造模前及造模后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d大鼠右側(cè)足底機(jī)械縮足痛閾值(PWT)的變化情況,并采用Western Blot法檢測(cè)各組大鼠脊髓JAK2、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(p-STAT3)的表達(dá)。模型組和電針組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側(cè)PWT呈下降趨勢(shì),此后維持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍,其造模后各時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側(cè)PWT與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針組大鼠造模后7 d至造模后16 d右側(cè)PWT與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。模型組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào),與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05,＜0.01)。電針可緩解腰椎間盤突出癥大鼠神經(jīng)痛,其機(jī)制可能與抑制脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

電針;腰椎間盤突出癥;椎間盤移位,腰;JAK激酶2;信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3;大鼠

腰椎間盤突出癥(lumbar intervertebral disc herniation, LIDH)是一種臨床常見(jiàn)病,具體表現(xiàn)為髓核突出損害腰神經(jīng)根,誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏、無(wú)力,分布皮節(jié)感覺(jué)異常。本病全球年發(fā)病率為7.62%,好發(fā)于25～55歲人群[1]。LIDH給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療經(jīng)費(fèi)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān),其發(fā)病機(jī)制主要是由炎癥反應(yīng)和髓核機(jī)械性壓迫神經(jīng)根導(dǎo)致[2]。針灸以中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo),是我國(guó)最古老的治療方法之一。在2017年美國(guó)內(nèi)科年鑒發(fā)表的腰痛治療指南中,美國(guó)醫(yī)師學(xué)會(huì)將針灸推薦為治療急性和慢性腰痛的一線療法[3]。JAK激酶(Janus kinase, JAK)-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(singal transducer and activator of transcription, STAT)細(xì)胞因子刺激信號(hào)通路可調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng),參與神經(jīng)病理性疼痛的形成過(guò)程。在慢性縮窄性壓迫性坐骨神經(jīng)損傷的神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠中,其脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路的相關(guān)蛋白可被激活[4-5]。本實(shí)驗(yàn)擬建立自體髓核移植構(gòu)建LIDH模型大鼠,探索LIDH模型大鼠的脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路是否激活,通過(guò)觀察電針對(duì)LIDH大鼠脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探索電針治療LIDH的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,體重為(200±20)g,由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察室明暗各12 h,溫度控制在20～22℃,相對(duì)濕度為50%～70%,自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,待大鼠適應(yīng)新環(huán)境且飲食、活動(dòng)正常后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物使用和管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

JAK2、磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)、STAT3、磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(p-STAT3)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司);Labsystems wellscan mk3酶標(biāo)儀(Labsystems, Finland);Image quant lAS超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀(GEHC, Switzerland);Von frey絲(美國(guó)Stoelting公司);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)顯微鏡;顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠);0.30 mm×25 mm無(wú)菌針灸針(固始公元醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 造模方法

采用自體髓核移植構(gòu)建LIDH模型[6-7]。具體操作為,用40 mg/kg戊巴比妥行腹腔注射麻醉,取大鼠尾椎髓核共2 mg,并沿腰背部切開(kāi)皮膚,鈍性分離右側(cè)L4-S2的椎旁肌肉,將右側(cè)L5下關(guān)節(jié)突、L6上關(guān)節(jié)突和L5椎板切除,暴露右側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)及部分硬膜外腔,將尾椎髓核放置右側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)及硬膜外腔附近,避免造成機(jī)械性壓迫,逐層縫合傷口,手術(shù)后腹腔注射10萬(wàn)單位的青霉素消炎。術(shù)后3 d內(nèi),每日采用碘伏對(duì)傷口進(jìn)行抗菌處理。

1.4 動(dòng)物分組及處理

采用查隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組,每組12只。

正常組采用正常飼養(yǎng),不給予任何手術(shù)處理;模型組和電針組采用自體髓核移植構(gòu)建LIDH模型;假手術(shù)組除未放置髓核外,其余步驟均同模型組和電針組。

電針組術(shù)后3 d開(kāi)始電針治療。取右側(cè)腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽(yáng)陵泉穴。在安靜環(huán)境下,將大鼠放置在大鼠固定器架上固定,露出右側(cè)腰部及四肢,待大鼠安靜后,采用75%乙醇棉球進(jìn)行消毒,用0.30 mm×25 mm毫針直刺10～15 mm,然后連接電針儀(腎俞、大腸俞為1組,環(huán)跳、陽(yáng)陵泉為1組),采用連續(xù)波,頻率為2 Hz,強(qiáng)度1 mA,留針20 min。每日1次,共治療14 d。在電針組治療期間,正常組、假手術(shù)組、模型組每日均做相同的固定處理,每次20 min。

1.5 標(biāo)本采集

采用40 mg/kg戊巴比妥行腹腔注射麻醉后,開(kāi)胸,輸液針刺入心尖部,灌注生理鹽水,剪開(kāi)右心耳,觀察灌注液血色是否變淡,待大鼠肺臟及肝臟顏色變白后,將大鼠放置于冰上,取俯臥位,迅速暴露脊髓,取出脊髓腰膨大節(jié)段,并分離右側(cè)脊髓節(jié)段后放入液氮罐速凍,最后放入-80℃冰箱保存。為觀察電針治療過(guò)程中指標(biāo)蛋白的變化情況,故選取造模后9 d、16 d進(jìn)行取材。其中造模后9 d為電針治療周期的一半。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組取6只大鼠。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 機(jī)械縮足痛閾值測(cè)定

將大鼠放在金屬網(wǎng)格板上,待大鼠安靜適應(yīng)環(huán)境10～30 min后開(kāi)始測(cè)定。采用up-down法測(cè)定大鼠造模前及造模后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d右后肢機(jī)械縮足痛閾值(paw withdrawal threshold, PWT)。用von Frey hair纖維絲垂直刺激大鼠右側(cè)掌跖部無(wú)毛處,von Frey hair呈“S”型,持續(xù)作用6～8 s,相鄰刺激間隔至少7 s,大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)。刺激過(guò)程中,大鼠走動(dòng)或受到刺激就抬足視為可疑陽(yáng)性,需等大鼠安靜下來(lái)后再行測(cè)量。陽(yáng)性結(jié)果為X,陰性結(jié)果為O。

1.6.2 Western blot檢測(cè)

按照20 mg組織加入150～200 mL RIPA蛋白裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑),采用超聲破碎儀進(jìn)行研磨勻漿(以上操作均在冰上進(jìn)行)。4℃下12000 rpm離心15 min,取上清液。運(yùn)用BCA法測(cè)定蛋白濃度,并通過(guò)調(diào)節(jié)使各組樣品總蛋白濃度相等。選擇配制10%分離膠,取100mg樣品上樣,用彩染marker指示標(biāo)準(zhǔn)SDS- PAGE膠。積層膠90 V電泳20～30 min,至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠頂部;電壓調(diào)整至120 V電泳50～70 min,最后200 mA恒流轉(zhuǎn)膜90～120 min。將PVDF膜放置封閉液(5%脫脂奶粉的TBST)室溫封閉1 h后,用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(p-STAT3采用1:1000稀釋,STAT3采用1:1000稀釋,p-JAK2采用1:1000稀釋,JAK2采用1:1000稀釋),使PVDF膜浸泡在一抗孵育液,4℃孵育過(guò)夜。PVDF膜用TBST清洗3遍,每次清洗5 min。然后孵育二抗,用封閉液稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:1000)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1:1000),將PVDF膜浸泡在二抗孵育液,室溫孵育1 h。TBST清洗3遍,每次清洗5 min。在PVDF膜上加上特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,Image Quant LAS超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀顯示結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)PWT比較

由圖1、表1可見(jiàn),各組大鼠造模前右側(cè)PWT比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (＞0.05)。假手術(shù)組大鼠造模后1 d右側(cè)PWT有所下降,與正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);而假手術(shù)組大鼠造模后3 d右側(cè)PWT有所提高,與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組大鼠造模后1 d至造模后7 d右側(cè)PWT呈下降趨勢(shì),此后維持在相對(duì)穩(wěn)定的范圍,其造模后各時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側(cè)PWT均顯著低于正常組和假手術(shù)組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。電針組大鼠造模后1 d至造模后5 d右側(cè)PWT呈下降趨勢(shì),但與模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);而電針組大鼠造模后7 d至造模后16 d右側(cè)PWT則呈上升趨勢(shì),與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);電針組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)(1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、16 d)右側(cè)PWT與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)右側(cè)PWT比較 (±s,g)

注:與正常組比較1)＜0.05;與假手術(shù)組比較2)＜0.05;與模型組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠造模后9 d和16 d脊髓JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較

注:與正常組比較1)P＜0.01;與假手術(shù)組比較2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05

注:與正常組比較1)P＜0.01;與假手術(shù)組比較2)P＜0.01;與模型組比較3)P＜0.01

由圖2、圖3可見(jiàn),各組造模后9 d和16 d JAK2、STAT3蛋白含量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。正常組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白含量與假手術(shù)組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)顯著上調(diào),與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05,＜0.01)。

3 討論

目前,髓核的生化因素在LIDH發(fā)病機(jī)制中的作用已日益受到重視。椎間盤髓核含有較多非特異性致炎物,如白介素6、前列腺素E2、白介素1a,可產(chǎn)生炎癥性疼痛[8-9]。自體髓核移植構(gòu)建LIDH模型,其髓核內(nèi)的炎性物質(zhì)可引起炎癥反應(yīng),將外周傷害性信息傳入脊髓中樞,促進(jìn)脊髓釋放炎性細(xì)胞因子[10]。該模型具有創(chuàng)傷小,不易感染,可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

LIDH屬于中醫(yī)學(xué)“腰腿痛”范疇。賈紅玲等[11]應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)近10年來(lái)針灸治療LIDH的腧穴使用情況進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所選腧穴主要以膀胱經(jīng)和膽經(jīng)為主。本實(shí)驗(yàn)選取膀胱經(jīng)的腎俞、大腸俞和膽經(jīng)的環(huán)跳、陽(yáng)陵泉進(jìn)行治療。環(huán)跳為疏通下肢少陽(yáng)、太陽(yáng)經(jīng)氣之要穴;陽(yáng)陵泉為八會(huì)穴之筋會(huì),主治下肢經(jīng)筋病癥要穴,環(huán)跳、陽(yáng)陵泉配用可疏通經(jīng)絡(luò);腎俞、大腸俞均為局部取穴,可刺激穴位促進(jìn)神經(jīng)及血管功能,改善局部血液循環(huán),減輕神經(jīng)疼痛癥狀[12]。研究表明,多次重復(fù)針刺具有累積效應(yīng),其療效隨著治療次數(shù)的增加而明顯提升[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,從造模后7 d(電針治療5次)治療結(jié)束后開(kāi)始,電針組大鼠右側(cè)PWT明顯高于模型組,且隨著治療次數(shù)的增加,電針組大鼠右側(cè)PWT也隨之明顯提高。

JAK-STAT信號(hào)通路可參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及免疫調(diào)節(jié)。激活JAK-STAT信號(hào)通路,主要通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)的磷酸化水平[14-15]。JAK-STAT信號(hào)通路激活后,可引起目的基因表達(dá),釋放一氧化氮、花生四烯酸、前列腺素、興奮性氨基酸等物質(zhì)[16]。本實(shí)驗(yàn)Western Blot分析結(jié)果顯示,模型組造模后9 d和16 d脊髓p-JAK2、p-STAT3的蛋白含量明顯升高,表明自體髓核可激活脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路。

李軍軍[5]對(duì)2型糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠的環(huán)跳、陽(yáng)陵泉給予2 Hz/1 mA的電針治療后,可改善大鼠痛敏,其脊髓p-JAK2、p-STAT3的蛋白水平表達(dá)明顯降低,表明電針可能是通過(guò)抑制脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路來(lái)減輕2型糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠的癥狀。本實(shí)驗(yàn)對(duì)LIDH模型大鼠右側(cè)腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽(yáng)陵泉給予2 Hz/1 mA的電針治療,Western blot分析結(jié)果顯示電針組造模后9 d和16 d p-JAK2、p-STAT3蛋白含量明顯降低,與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05,＜0.01),說(shuō)明電針治療LIDH的作用機(jī)制可能與抑制脊髓JAK2-STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,本研究表明電針可提高LIDH模型大鼠的痛閾,減輕神經(jīng)痛;同時(shí),電針可降低脊髓p-JAK2、p-STAT3蛋白含量,故筆者推測(cè)電針治療LIDH的機(jī)制可能與抑制JAK2-STAT3信號(hào)通路有關(guān),針對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的調(diào)控今后可能成為治療LIDH的新靶點(diǎn)。然而,本實(shí)驗(yàn)的觀察樣本量較小,觀察的時(shí)間點(diǎn)相對(duì)較短,今后研究可增大樣本量,延長(zhǎng)治療周期,還可采用JAK2-STAT3信號(hào)通路的抑制劑進(jìn)行干預(yù),從而深入探索電針的治療機(jī)制。

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To observe the intervention effect of electroacupuncture in rats with lumbar intervertebral disc herniation (LIDH) and its effect on spinal Janus kinase 2 (JAK2)-signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) pathway.Forty-eight male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a normal group, a sham operation group, a model group and an electroacupuncture group, with 12 rats in each group. Autologous nucleus pulposus transplantation was adopted to prepare the rat model of LIDH. The electroacupuncture group was intervened by electroacupuncture at Shenshu (BL23), Dachangshu (BL25), Huantiao (GB30) and Yanglingquan (GB34) on the right side. The right plantar mechanical paw withdrawal threshold (PWT) of rats in all groups was observed before modeling and 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling. The expression of JAK2, phosphorylated JAK2 (p-JAK2), STAT3 and phosphorylated STAT3 (p-STAT3) in rat’s spinal cord were examined by using Western blotting method.The right PWT at different time points (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling) in the model group and electroacupuncture group showed a downward trend, and then remained in a relatively stable range. The right PWTs at different time points (1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 16 days after modeling) in the model group and electroacupuncture group were significantly different from those in the normal group and sham operation group (＜0.05). The right PWTs at different time points (from day 7 till day 16 after modeling) in the electroacupuncture group were significantly different from those in the model group (＜0.05). Compared with the normal group and sham operation group, the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins were significantly up-regulated at different time points (9 and 16 days after modeling) in the model group(＜0.01). Compared with the model group, the expressions of p-JAK2 and p-STAT3 proteins decreased significantly at different time points (9 and 16 days after modeling) in the electroacupuncture group(＜0.05,＜0.01).Electroacupuncture can relieve neuralgia of LIDH rats, and the action mechanism is possibly related to the inhibition of spinal JAK2-STAT3 pathway.

Electroacupuncture; Lumbar disc intervertebral herniation; Intervertebral disc displacement, Lumbar; Janus kinase 2; Signal transducer and activator of transcription 3; Rats

1005-0957(2018)10-1207-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.10.1207

2018-06-03

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16401933900)

林元杰(1990—),男,2015級(jí)碩士生,Email:1034238903@qq.com

吳耀持(1961—),男,教授,博士生導(dǎo)師,Email:18930177222@163.com