氧化應(yīng)激參與調(diào)控磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬

鄔珊珊徐璐瑤朱佳慧王靈杰錢煜峰毛紅嬌張?jiān)茋?yán)明

1紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院（浙江紹興312000）

2杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院（浙江杭州310018）

假體翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過長(zhǎng)期磨損、碰撞會(huì)產(chǎn)生大量的聚乙烯（polyeth?ylene，PE）、金屬鈦（titanium，Ti）和陶瓷磷酸三鈣（tri?calcium phosphate，TCP）等磨損顆粒，這些顆粒會(huì)刺激假體周圍單核/巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和前列腺素E2（PGE2），誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成及骨溶解[1，2]。假體周圍除了含有上述組織細(xì)胞外，還存在著豐富的骨細(xì)胞（os?teocyte），其數(shù)量占骨組織細(xì)胞90%～95%。骨細(xì)胞均勻分布于礦化的骨基質(zhì)中，能通過其豐富的偽足彼此連接形成骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，維持自身生理功能，合成并分泌DMP-1及SOST等分子調(diào)控骨表面的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)而影響骨重建[3，4]。因此，骨細(xì)胞是調(diào)控骨新陳代謝的主要細(xì)胞。

以往研究和我們前期實(shí)驗(yàn)表明磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡，釋放TNF-α和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL），后者促進(jìn)破骨細(xì)胞活化與骨溶解，而且假體周圍骨細(xì)胞凋亡先于破骨細(xì)胞的活化[5]，因此，關(guān)節(jié)假體植入后所產(chǎn)生的磨損顆粒能誘導(dǎo)骨細(xì)胞受損、凋亡，成為假體周圍骨溶解的重要啟動(dòng)者。此外，2016年Wang等[6]報(bào)道磨損顆?？烧T導(dǎo)骨細(xì)胞自噬，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和骨吸收。以上研究結(jié)果表明：磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬，促進(jìn)骨假體周圍溶解。

有證據(jù)顯示細(xì)胞凋亡、自噬與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7，8]，但是氧化應(yīng)激在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬中的作用如何？目前尚不清楚。本研究應(yīng)用前期成功構(gòu)建的TCP磨損顆粒誘導(dǎo)小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體釋放的磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解和無菌性松動(dòng)病理過程[2]，以小鼠顱骨溶解部位周圍骨細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）探討氧化應(yīng)激對(duì)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬中的影響，為防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動(dòng)提供新的靶細(xì)胞和治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建[2]與實(shí)驗(yàn)分組

ICR雄性小鼠36只，體重18～22 g，清潔級(jí)，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001，合格證號(hào)1603090018）。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度22°C～24°C，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，自然晝夜節(jié)律光照。

隨機(jī)分為正常組、TCP磨損顆粒（TCP）組和N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）組，每組12只。除正常組外，TCP組和NAC組小鼠分別經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長(zhǎng)約0.8 cm，分離皮下組織，露出面積為1 cm×1 cm方形顱骨區(qū)域，取TCP磨損顆粒30 mg置于小鼠顱骨中縫骨膜上縫合皮膚構(gòu)建小鼠顱骨溶解模型。NAC處理組小鼠于術(shù)后第2天顱頂皮下注射NAC（1.0 mg/kg），2天1次。持續(xù)干預(yù)2周后處死動(dòng)物取血清和顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域）。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.3.1 HE染色

每組取6只小鼠顱骨，經(jīng)10%甲醛固定48 h和10%EDTA（pH7.4）脫鈣2周后進(jìn)行石蠟包埋，后經(jīng)切片機(jī)對(duì)顱骨矢狀面連續(xù)切片（5 μm），脫蠟后行HE染色。每只小鼠顱骨隨機(jī)選取4張切片置于IX70顯微鏡下觀察3個(gè)視野中假體周圍骨細(xì)胞活性及死亡（即空骨陷窩）情況變化，應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0（美國(guó)MediaCy?bernetics公司）軟件分析單位面積內(nèi)空骨陷窩數(shù)目。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)血清骨細(xì)胞特征蛋白SOST和DMP- 1水平

各組小鼠分別于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后眼球采血1.0 mL置于EP管中，待血液凝固后于3000 r/min（4°C）離心10 min，取上清液即為血清。利用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP-1）和硬化蛋白（SOST）試劑盒檢測(cè)小鼠血清中DMP-1和SOST水平。

1.3.3 骨細(xì)胞的獲取

參照方法分離骨細(xì)胞[9]。每組取6只小鼠顱骨，去除軟組織和骨膜后，與0.2%IV型膠原酶溶液（含70 mM NaCl，10 mM NaHCO3，60 mM sorbitol，30 mM KCl，3 mM K2HPO4，1 mM CaCl2，0.1%bovine serum albumin，0.5%glucose和25 mM HEPES）在37°C培養(yǎng)箱中孵育20 min。去除上清液，顱骨碎片在37°C與含5 mM EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中間吹打1次。PBS沖洗后，重復(fù)以上消化步驟4次，收集最后2步消化后的上清液含有大量的骨細(xì)胞。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨細(xì)胞細(xì)胞凋亡及ROS水平

各組骨細(xì)胞重懸于適量PBS中，制成單細(xì)胞懸液，分別加入TUNEL（5 μL/管）或DCFH-DA（2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，10 μmol/L），避光孵育15～30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平[5]。

1.3.5 骨細(xì)胞蛋白提取和比色法檢測(cè)假體周圍骨細(xì)胞MDA含量和SOD活性

各組骨細(xì)胞加入RIPA（100 μL）裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min離心15 min收集上清液即為總蛋白，通過BCA?試劑盒檢測(cè)各組總蛋白濃度。利用丙二醛（MDA）和SOD試劑盒檢測(cè)各組骨細(xì)胞中MDA含量和SOD活性的變化。

1.3.6 Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)[10]

各組骨細(xì)胞蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣 30 μg蛋白，行 12%SDSPAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔源性一抗 Beclin-1（1:1000）、LC-3（1︰1000）和β-actin（1︰1000）4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞損傷情況比較

與正常組比較，TCP組小鼠假體周圍骨細(xì)胞活性顯著下降，空骨陷窩數(shù)量明顯增加（P＜0.05，圖1），血清中骨細(xì)胞特征蛋白DMP-1水平降低，SOST水平上升，造成DMP-1/SOST顯著減少，僅為正常組的39.20%（P＜0.05，圖2）。與TCP組比較，NAC組假體周圍空骨陷窩數(shù)量及DMP-1/SOST明顯增加（P＜0.05，圖1、圖2）。

圖1 HE染色觀小鼠假體周圍骨細(xì)胞活性（n=6）

圖2 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中SOST和DMP-1水平（n=12）

2.2 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞凋亡情況

與正常組比較，TCP組假體周圍骨細(xì)胞凋亡明顯，其凋亡率高達(dá)28.02%，為正常組的7.22倍（P＜0.05，圖3）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細(xì)胞凋亡顯著減少，僅為TCP組的32.05%（P＜0.05，圖3）。

圖3 TUNEL染色流式細(xì)胞術(shù)定量分析小鼠假體周圍骨細(xì)胞凋亡（n=6）

2.3 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激情況比較

與正常組比較，TCP組小鼠假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為骨細(xì)胞中MDA和ROS含量明顯增加，SOD活性顯著降低，分別為正常組的的3.10倍、5.25倍和53.57%（P＜0.05，圖4、圖5）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細(xì)胞中MDA和ROS含量顯著降低，SOD活性明顯增加。

圖4 化學(xué)比色法檢測(cè)小鼠假體周圍骨細(xì)胞中MDA含量和SOD 活性（n=6）

圖5 DCFH-DA染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)ROS水平（n=6）

2.4 各組小鼠假體周圍骨細(xì)胞自噬的活化比較

與正常組比較，TCP組假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換顯著增加，造成LC-3II/LC-3I上升（P＜0.05，圖6）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細(xì)胞中Beclin-1和LC-3表達(dá)顯著降低，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換也明顯減少，LC-3II/LC-3I下降（P＜0.05，圖6）。

圖6 Western blot法檢測(cè)小鼠假體周圍骨細(xì)胞自噬的活化（n=6）

3 討論

骨細(xì)胞的數(shù)量、活性及其功能對(duì)骨重建起著重要的作用[2，11]，而骨細(xì)胞凋亡常常伴隨著骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等骨吸收疾病的發(fā)生，同時(shí)造成骨脆性增加及骨修復(fù)能力減弱[10，11]。Emerton等[12]研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)大鼠股骨和肱骨中骨細(xì)胞凋亡，增加局部骨吸收及骨脆性。2016年Cabahug-Zuckerman研究小組報(bào)道后肢卸載的小鼠股骨皮質(zhì)骨和骨小梁中骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，骨吸收顯著；應(yīng)用Caspase抑制劑QVD能顯著抑制上述骨細(xì)胞凋亡和骨吸收[13]。本研究結(jié)果顯示TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為TCP組假體周圍骨細(xì)胞死亡、功能損傷和骨細(xì)胞凋亡顯著（圖2、圖3），與TCP磨損顆粒所造成的假體周圍骨溶解趨勢(shì)一致[2，6]。提示：骨細(xì)胞凋亡參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍破骨細(xì)胞活化和骨溶解。

另有研究證實(shí)骨細(xì)胞自噬也調(diào)控骨吸收。近年有研究顯示糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型中骨細(xì)胞發(fā)生自噬[14]；2014年Yang等[15]也報(bào)道去卵巢大鼠脛骨近端的骨細(xì)胞自噬水平顯著增加，且自噬的活化程度與骨吸收呈正相關(guān)。2016年Wang研究發(fā)現(xiàn)TiAl6V4顆粒能誘導(dǎo)骨細(xì)胞MLO-Y4自噬，而干擾自噬相關(guān)基因Atg5可顯著抑制破骨細(xì)胞生成[6]。與之類似，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明TCP磨損顆?？烧T導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生自噬，自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC-3表達(dá)顯著增加，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換明顯（圖4）。以上研究結(jié)果表明：自噬和凋亡均參與了TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞損傷。

大量研究顯示氧化應(yīng)激參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬[7，8]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體自由基、ROS產(chǎn)生過多或機(jī)體抗氧化能力減弱，ROS清除不足，體內(nèi)ROS蓄積超出了機(jī)體的清除能力，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡而造成細(xì)胞、組織氧化損傷的病理過程。有研究表明松動(dòng)假體周圍組織中ROS水平較高，大量的ROS攻擊假體周圍組織細(xì)胞后引起氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）和MDA等含量增加，改變細(xì)胞膜通透性進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示TCP磨損顆粒可誘導(dǎo)假體周圍骨細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為TCP組小鼠假體周圍骨細(xì)胞內(nèi)MDA和ROS含量明顯增加，抗氧化物質(zhì)SOD活性顯著降低；其氧化應(yīng)激活化程度類似于地塞米松誘導(dǎo)體外培養(yǎng)骨細(xì)胞MLO-Y4產(chǎn)生ROS[19]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC能明顯減輕TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬，與2015年Tak?eno等[20]和Fontani等[21]觀察到的NAC對(duì)血清剝奪或血漿同型半胱氨酸誘導(dǎo)骨細(xì)胞MLO-Y4凋亡的影響效果基本一致。但是，對(duì)于氧化應(yīng)激介導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡和自噬具體機(jī)制如何？還需要我們以后進(jìn)行深入地研究。

4 結(jié)論

氧化應(yīng)激參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨細(xì)胞凋亡和自噬，促進(jìn)骨細(xì)胞死亡及假體周圍骨溶解。