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    4周有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)apelin對小鼠骨骼肌UCP3表達(dá)的影響

    2018-10-16 02:57:14王楊文潔劉肇杰安惠暄張纓
    關(guān)鍵詞:攝食骨骼肌有氧

    王楊文潔 劉肇杰 安惠暄 張纓

    北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院(北京100084)

    運(yùn)動(dòng)引起肌肉收縮產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)——肌肉因子,是調(diào)控骨骼肌能量代謝的重要因素[1]。Ape?lin作為近年來新發(fā)現(xiàn)的肌肉因子[2],被認(rèn)為可能參與了運(yùn)動(dòng)調(diào)控骨骼肌能量代謝的作用。

    Apelin的前體是包含77個(gè)氨基酸的多肽原,可被剪切為多種具有生物活性的片段,這些片段均含有apelin-13的氨基酸序列,因此apelin-13被認(rèn)為是ape?lin的基本結(jié)構(gòu)[3-5]。已有研究報(bào)道,apelin-13 C末端的苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)被丙氨酸(alanine,Ala)所替代,形成異構(gòu)體apelin-13(F13A),被認(rèn)為是ape?lin-13的拮抗劑[6,7]。而另有研究報(bào)道,苯丙氨酸缺失的apelin片段仍具有結(jié)合和活化apelin受體的功能[8-11],故F13A被認(rèn)為是apelin-13的類似物,與apelin-13的作用相同。因此,F(xiàn)13A的具體作用還需進(jìn)一步證實(shí)。

    Apelin作為細(xì)胞膜上G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體,廣泛表達(dá)于中樞系統(tǒng)和外周組織(如心臟、肺、腎臟、脂肪組織和骨骼肌等)中[10]。Apelin可通過內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于APJ,進(jìn)而參與調(diào)節(jié)心血管功能[12]、體液平衡[13]等,而在能量代謝(特別是骨骼?。┓矫娴淖饔弥钡浇陙聿攀艿疥P(guān)注。已有研究表明,apelin與細(xì)胞膜上的APJ結(jié)合后,可上調(diào)骨骼肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平和過氧化體增殖活化受體γ輔助活化因子(peroxisome proliferator-activated receptor γ co?activator-1α,PGC-1α)的蛋白表達(dá),進(jìn)而調(diào)控骨骼肌能量代謝[14-16]。解偶聯(lián)蛋白(uncoupling proteins,UCPs)是分布于線粒體內(nèi)膜上的一類產(chǎn)熱蛋白,可介導(dǎo)線粒體呼吸鏈的代謝物脫氫氧化和ADP磷酸化過程解偶聯(lián),使產(chǎn)生的能量以熱能的形式釋放,其中解偶聯(lián)蛋白3(uncoupling proteins 3,UCP3)是主要在骨骼肌中表達(dá)的解偶聯(lián)蛋白,是哺乳動(dòng)物體溫的重要調(diào)控因子[17,18]。另外,UCP3還可促進(jìn)脂肪酸氧化,并對體重、體脂和靜息代謝率等產(chǎn)生影響[19-21]。也有文獻(xiàn)報(bào)道,骨骼肌UCP3的表達(dá)可能受AMPK、PGC-1α的調(diào)控[22-25]。目前雖然已有研究表明有氧運(yùn)動(dòng)可增加骨骼肌apelin/APJ的表達(dá)[26],但有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)apelin是否對骨骼肌UCP3的表達(dá)產(chǎn)生影響及其可能的調(diào)節(jié)通路并不清楚。

    本研究采用C57BL/6J雄性小鼠為研究對象,通過4周有氧運(yùn)動(dòng)并腹腔注射生理鹽水或F13A,觀察小鼠骨骼肌apelin、APJ、AMPK、p-AMPK、PGC-1α及UCP3蛋白表達(dá)和能量代謝相關(guān)指標(biāo)的變化,探討4周有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)apelin對小鼠骨骼肌UCP3表達(dá)的影響及可能的機(jī)制,觀察F13A在本研究中的具體作用。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象與分組

    SPF級健康4周齡的C57BL/6J雄性小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證:SCXK(京)2015-0001)40只,于北京體育大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)房(飼養(yǎng)許可證編號:SYXK(京)2011-0034)中分籠飼養(yǎng),每籠5只。動(dòng)物飼養(yǎng)房室溫控制在20~25℃,相對濕度50%~70%,12︰12 h晝夜循環(huán)照明(光照時(shí)間7:00~19:00),國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。

    適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后,8周齡小鼠體重22.55±4.08 g,按體重隨機(jī)分為生理鹽水組(Saline,S)和F13A組(F13A,F(xiàn)),每組20只;各組再隨機(jī)分為安靜組(Con?trol,C)和運(yùn)動(dòng)組(Exercise,E),分別為生理鹽水安靜組(SC)、生理鹽水運(yùn)動(dòng)組(SE)、F13A安靜組(FC)、F13A運(yùn)動(dòng)組(FE),每組10只。

    1.2 干預(yù)方案

    F13A組小鼠通過腹腔注射F13A(瑞士Bachem公司;H-7752)0.2μmol/kg/day[6,20];Saline組小鼠以同樣的方式注射300μl生理鹽水作為對照。注射時(shí)間為每天15:00,持續(xù)28天。

    安靜組小鼠正?;\中活動(dòng),不施加任何運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。

    正式實(shí)驗(yàn)前3天,運(yùn)動(dòng)組小鼠分別進(jìn)行10 min、20 min、40 min的適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練,方案為:坡度5°,速度15 m/min。正式實(shí)驗(yàn)為跑臺(tái)有氧運(yùn)動(dòng),前2周坡度為5°,速度15 m/min(約70%~75%最大攝氧量強(qiáng)度),60 min/天,6天/周;2周訓(xùn)練后,采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測系統(tǒng)(美國Columbus Instruments)對小鼠進(jìn)行最大攝氧量的測量,根據(jù)測量結(jié)果,調(diào)整后2周的訓(xùn)練方案為坡度5°,速度20 m/min(約70%~75%最大攝氧量強(qiáng)度),60 min/天,6天/周。跑臺(tái)訓(xùn)練共持續(xù)4周。

    1.3 取材

    最后一次運(yùn)動(dòng)后48 h,進(jìn)行摘眼球取血,在內(nèi)壁涂有EDTA的抗凝管中靜置30 min,后轉(zhuǎn)速3000 rpm,離心15 min,分離出的血漿凍存在-20℃?zhèn)溆?;取血后立即脫頸處死,迅速取兩側(cè)小腿三頭肌,稱量,用錫紙包裹標(biāo)記,投入液氮,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱,保存待用。

    1.4 指標(biāo)測定

    1.4.1 攝食量、體重監(jiān)控

    每天14:00定時(shí)稱量籠中飼料量,計(jì)算每組每天平均攝食量。分別稱量4周干預(yù)前后小鼠的體重,并計(jì)算干預(yù)前后體重的變化量。

    1.4.2 WesternBlot測定骨骼肌apelin、APJ、AMPK α、p-AMPK α(Thr172)、PGC- 1 α、UCP 3的蛋白表達(dá)

    100 mg骨骼肌加入800μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天),剪碎,超速勻漿;冰盒中靜置30 min,隨后轉(zhuǎn)速12000 rpm、4℃離心30 min,取上清液,將提取的總蛋白置于-20℃,保存待用。

    采用BCA法對總蛋白濃度進(jìn)行測定(BCA Protein Assay Reagent,美國Thermo Scientific公司)。根據(jù)測定的總蛋白濃度,以上樣量20μg/次,計(jì)算總蛋白上樣量,進(jìn)行配樣。采用Blot 4%~12%Bis-Tris Plus凝膠(美國life technologies公司)和NuPAGE MES SDS(1×)電泳緩沖液(美國life technologies公司)進(jìn)行電泳,后用iBlot Gel Transfer System(美國Invitrogen公司)將電泳后蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。標(biāo)記目的條帶后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h。用相應(yīng)的一抗在4℃孵育過夜,一抗的稀釋比例依次是:1︰500的apelin(美國Santa Cruz Biotechnology,sc-293441)、1︰2000 的 APJ(美國Santa Cruz Biotechnology,sc-33823)、1︰1000的AMPKα(美國Santa Cruz Biotechnology,sc-74461)、1︰1000的p-AMPKα(美國Santa Cruz Biotechnology,sc-33524)、1︰500的 PGC-1α(美國 Santa Cruz Biotechnology,sc-13067)、1︰2000 的 UCP3(美國Santa Cruz Biotechnolo?gy,sc-31387)和1︰1000的總蛋白內(nèi)參β-Tubulin(Pro?teintech Group,10094-1-AP)。

    次日用1×TBST洗脫,10 min/次,共3次。洗脫后用相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1 h,二抗的稀釋比例分別是:1︰1000的apelin(羊抗小鼠,中科晨宇,164018)、1︰1000的APJ(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301)、1︰5000的AMPKα(羊抗小鼠,中科晨宇,164018)、1︰2000的p-AMPKα(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301)、1︰1000的PGC-1α(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301)、1︰4000的UCP3(兔抗羊,中科晨宇,164036)和1︰5000的β-Tu?bulin(羊抗兔,中杉金橋,ZB-2301)。之后用1×TBST洗脫,10 min/次,共3次。加入發(fā)光液顯影,放入Bio-Rad凝膠成像儀曝光,拍照。使用Image Lab軟件對條帶進(jìn)行檢測分析,讀取積分灰度值。計(jì)算公式如下:

    1.4.3 測定血漿總apelin含量

    小鼠血漿樣本置于冰上備用,采用apelin酶聯(lián)免疫試劑盒(美國Sigma公司;RAB00181KT)測定血漿總apelin的含量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。在方差齊性的條件下,采用雙因素方差分析對藥物和運(yùn)動(dòng)因素的主效應(yīng)以及兩因素的交互作用進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若兩因素有交互作用(P<0.05),則采用LSD法進(jìn)行簡單效應(yīng)檢驗(yàn);若兩因素?zé)o交互作用,同一因素內(nèi)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平以P<0.05表示具有顯著性差異;P<0.01表示非常顯著性差異。

    2 研究結(jié)果

    2.1 攝食量和體重變化

    如圖1所示,F(xiàn)C組與SC組相比,小鼠攝食量無顯著性變化。SE組與SC組相比,攝食量呈增加趨勢,但沒有顯著性差異。而FE組與FC組相比,除了第20天之外,攝食量在其余時(shí)間均顯著性增加(P<0.05或0.01)。如圖2所示,F(xiàn)C組與SC組相比,小鼠體重?zé)o顯著性差異;SE和FE組分別與其Control組相比,小鼠體重均呈下降的趨勢,但無顯著差異。

    圖1 平均攝食量的變化

    圖2 體重的變化

    2.2 骨骼肌蛋白表達(dá)的變化

    2.2.1 Apelin蛋白表達(dá)

    如圖3所示,與SC組相比,F(xiàn)C組和SE組小鼠骨骼肌apelin蛋白表達(dá)均顯著性增加(P<0.05);FE組與FC組相比,骨骼肌apelin蛋白表達(dá)非常顯著性增加(P<0.01)。

    圖3 骨骼肌apelin蛋白表達(dá)的變化

    2.2.2 APJ蛋白表達(dá)

    如圖4所示,F(xiàn)C組與SC組相比,骨骼肌APJ蛋白表達(dá)無顯著性差異。SE組與其Control組相比,APJ蛋白表達(dá)呈增加趨勢,但無顯著性差異。而FE組與FC組相比,APJ蛋白表達(dá)非常顯著性增加(P<0.01)。

    2.2.3 AMPK α、p-AMPK α(Thr172)蛋白表達(dá)及p-AMPK α(Thr172)/AMPK α 比值

    如圖5所示,SE組與其Control組相比,骨骼肌p-AMPKα(Thr172)蛋白表達(dá)顯著性增加(P<0.05);同時(shí),F(xiàn)E組與其Control組相比,骨骼肌p-AMPKα(Thr172)蛋白表達(dá)和p-AMPKα(Thr172)/AMPKα比值呈現(xiàn)顯著性增加(P<0.01,P<0.05)。

    圖5 骨骼肌AMPKα、p-AMPKα(Thr172)蛋白表達(dá)及p-AMPKα(Thr172)/AMPKα比值的變化

    2.2.4 PGC- 1 α蛋白表達(dá)

    如圖6所示,F(xiàn)E組與FC組相比,PGC-1α蛋白表達(dá)顯著性增加(P<0.05)。

    圖6 骨骼肌PGC-1α蛋白表達(dá)的變化

    2.2.5 UCP 3蛋白表達(dá)

    如圖7所示,F(xiàn)E組與FC組相比,UCP3蛋白表達(dá)顯著性增加(P<0.05)。

    圖7 骨骼肌UCP3蛋白表達(dá)的變化

    2.3 血漿中總apelin含量

    如圖8所示,F(xiàn)E組與FC組相比,血漿apelin濃度顯著性降低(P<0.05)。

    圖8 血漿apelin含量的變化

    3 討論

    3.1 F13 A與有氧運(yùn)動(dòng)對小鼠骨骼肌apelin、APJ、AMPK α、p-AMPK α(Thr172)、PGC- 1 α和UCP 3 蛋白表達(dá)的影響

    APJ作為apelin機(jī)體內(nèi)的天然配體,在apelin轉(zhuǎn)基因小鼠股四頭肌中APJ mRNA表達(dá)顯著性增加[27]。對胰島素抵抗小鼠4周腹腔注射apelin-13,比目魚肌中的p-AMPKα/AMPKα比值顯著升高,并顯著上調(diào)PGC-1α mRNA的表達(dá)[6]。另有研究表明,C2C12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PGC-1α,可通過線粒體代謝產(chǎn)生ROS,上調(diào)UCP3 mRNA表達(dá)[28]。因此,由上述實(shí)驗(yàn)推測,apelin的干預(yù)可促進(jìn)骨骼肌中apelin/APJ表達(dá),進(jìn)而激活A(yù)MPK—PGC-1α信號通路,增強(qiáng)UCP3的表達(dá)以調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝。在本研究中,單純注射F13A后僅小鼠小腿三頭肌apelin的蛋白表達(dá)顯著性增加,而APJ、p-AMPKα(Thr172)/AMPKα、PGC-1α及UCP3的表達(dá)均無顯著性變化。分析其原因可能是由于:1)F13A生物活性可能低于apelin。Yang等[11]通過對apelin結(jié)構(gòu)的研究提出,F(xiàn)13A雖具有與apelin-13相同的結(jié)合與激活apelin受體—APJ的生物學(xué)作用,但其生物活性弱于apelin-13;2)本實(shí)驗(yàn)采用的是小腿三頭肌,而F13A可能對不同骨骼肌肌纖維類型的作用不同。

    運(yùn)動(dòng)刺激骨骼肌收縮可產(chǎn)生并分泌apelin[2]。AMPK作為細(xì)胞代謝的能量感受器,大鼠在一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后3小時(shí)股四頭肌AMPKα磷酸化水平顯著升高,并上調(diào)PGC-1α的mRNA和蛋白表達(dá)[29]。另有研究采用電刺激模擬運(yùn)動(dòng)刺激,干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)骨骼肌中AMPKα磷酸化水平、PGC-1α蛋白表達(dá)及UCP3 mRNA表達(dá)顯著性升高[30]。高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后,可顯著增加比目魚肌和腓腸肌中apelin、APJ mRNA和蛋白表達(dá)量[26]。那么,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否可通過apelin/APJ—AMPK—PGC-1α,促進(jìn)骨骼肌UCP3蛋白表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝?在本研究中,單純4周有氧運(yùn)動(dòng)后小鼠小腿三頭肌apelin的蛋白表達(dá)顯著性增加,而APJ、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α及UCP3表達(dá)雖有增加趨勢,但無顯著性差異。推測可能與4周的有氧運(yùn)動(dòng)時(shí)間不足有關(guān),仍有待于進(jìn)一步確定。雖然單純F13A或有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù),小鼠骨骼肌這些蛋白表達(dá)均無顯著性差異,然而,注射F13A并進(jìn)行有氧運(yùn)動(dòng)組骨骼肌 apelin、APJ、p-AMPKα(Thr172)、PGC-1α 及UCP3蛋白表達(dá)均顯著性增加。提示有氧運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)機(jī)體對F13A干預(yù)的敏感性,促進(jìn)F13A介導(dǎo)骨骼肌apelin/APJ—AMPK—PGC-1α信號通路,提高UCP3的表達(dá),增強(qiáng)骨骼肌能量代謝調(diào)節(jié)。

    3.2 F13 A與有氧運(yùn)動(dòng)對小鼠攝食量和體重的影響

    在下丘腦外側(cè)區(qū)apelin/APJ的高表達(dá)可能提示apelin在食欲調(diào)節(jié)中的重要作用[31,32]。對小鼠第三腦室連續(xù)10天注射apelin-13(1μg/day),可促進(jìn)小鼠攝食量(第3-7天)的顯著性增加[33]。連續(xù)14天腹腔注射不同劑量(1、5和50μg/kg)apelin-13后,發(fā)現(xiàn)大鼠攝食量呈現(xiàn)劑量依賴性增長[32]。也有研究發(fā)現(xiàn),apelin轉(zhuǎn)基因鼠與野生型小鼠相比,無論高脂飲食或正常飲食其攝食量并無顯著性變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能與實(shí)驗(yàn)對象、apelin的干預(yù)方式不同有關(guān),其具體作用并不明確。在本研究中,單純F13A干預(yù)對小鼠攝食量并無顯著性影響,但F13A結(jié)合運(yùn)動(dòng)后,小鼠攝食量呈現(xiàn)顯著性增加。表明4周有氧運(yùn)動(dòng)可擴(kuò)大F13A對小鼠攝食量的調(diào)控作用,并推測這一攝食調(diào)控作用可能與上述骨骼肌apelin等蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

    UCP3作為骨骼肌脂質(zhì)代謝重要的調(diào)節(jié)因子,對體重變化有一定影響。UCP3基因敲除鼠骨骼肌中線粒體的脂肪酸氧化能力降低[21]。也有文獻(xiàn)表明,apelin-13(0.1μg/kg/day)干預(yù)后可增加骨骼肌UCP3 mRNA表達(dá),降低正常飲食和高脂飲食小鼠的體重和脂肪含量,而小鼠攝食量沒有顯著性變化[20]。但Tekin等[32]研究結(jié)果與上相反,SD雄性大鼠連續(xù)14天腹腔注射1、5、50μg/kg/day不同劑量apelin-13后,骨骼肌UCP3 mRNA表達(dá)均顯著性降低,而大鼠體重則顯著性升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,apelin-13干預(yù)后骨骼肌UCP3表達(dá)與體重可出現(xiàn)成反比例的關(guān)系。在本研究中,單純F13A干預(yù)對骨骼肌UCP3表達(dá)和小鼠體重均無顯著性影響;在F13A結(jié)合運(yùn)動(dòng)的FE組,與FC組相比雖然小鼠骨骼肌UCP3蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著性增加,但小鼠體重僅有降低的趨勢,也無顯著性差異。此結(jié)果是否與該組小鼠的攝食量顯著性增加有關(guān),仍需要進(jìn)一步確定。在本研究中若增加測定骨骼肌組織脂代謝相關(guān)指標(biāo),可能會(huì)有更好地解釋說明骨骼肌UCP3與脂代謝或體重的關(guān)系。

    3.3 F13 A與有氧運(yùn)動(dòng)對小鼠血漿apelin含量的影響。

    在本研究中,F(xiàn)E組與FC組相比,小鼠血漿apelin水平顯著降低,與骨骼肌apelin蛋白表達(dá)的結(jié)果相反。推測運(yùn)動(dòng)對apelin表達(dá)的影響在不同組織中可能不同。Yang等[26]研究顯示高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠進(jìn)行8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后,骨骼肌apelin和APJ表達(dá)增加,而脂肪組織和血漿中apelin、APJ水平顯著降低。此FE組小鼠血漿apelin水平的顯著降低可能與其脂肪組織apelin的表達(dá)水平相一致[34]。

    4 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)中,F(xiàn)13A保留著結(jié)合與激活A(yù)PJ受體的生物活性,是APJ受體的激動(dòng)劑。4周有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合腹腔注射F13A,可促進(jìn)骨骼肌apelin/APJ表達(dá),激活A(yù)MPK—PGC-1α信號通路,進(jìn)而提高UCP3蛋白表達(dá)。

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