液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中腺苷含量

程 浩

(安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051)

腺苷(Adenosine,AD) 是一種嘌呤核苷，是RNA的結(jié)構(gòu)片段，如圖1所示，它在生命活動中扮演著十分重要的角色。腺苷在生物機(jī)體內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種生理和病理生理過程，存在廣泛的心血管效應(yīng)，多年的臨床實(shí)踐證實(shí)在心血管疾病診斷和治療方面的有很高的應(yīng)用價(jià)值。腺苷是一種內(nèi)源性核苷，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生命體內(nèi)瘤細(xì)胞因生長速度快速，細(xì)胞容易引起缺氧和壞死，導(dǎo)致生物體內(nèi)腺嘌呤核苷酸降解產(chǎn)生大量腺苷，從而為腫瘤提供了快速生長的環(huán)境，導(dǎo)致腺苷在生物體內(nèi)濃度越來越高，蓄積在生物體內(nèi)。因此，腺苷作為腫瘤和其他疾病的潛在生物標(biāo)志物，在臨床診斷和生物醫(yī)學(xué)研究方面有十分重要意義。

目前，文獻(xiàn)中腺苷的檢測對象主要為中藥，例如冬蟲夏草、安喘舒丸、黨參、藍(lán)芩口服液等，有關(guān)血清中腺苷含量的檢測研究較少。由于人體血清中腺苷含量很低，液相色譜檢測的靈敏度遠(yuǎn)不能達(dá)到檢測的要求，因此，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體血漿中腺苷的含量，可以滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析的需求[1，4]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent 6460 LC/MS/MS，美國安捷倫公司)；去離子水發(fā)生器(Milli-Q型，美國Millipore公司)； 乙腈、甲酸 (色譜純，TEDIA，USA)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子高純水；有機(jī)微孔過濾膜(孔徑0.22 μm)；腺苷(Adenosine,AD，CAS: 58-61-7,分子式：C10H13N5O4美國sigma公司)。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：用電子天平精確稱取腺苷10mg于10 mL容量瓶，用50%(v/v)的甲醇水溶解定容，配制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備，置于-20℃冰箱保存。工作溶液根據(jù)實(shí)際需要用流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成適合濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 樣品前處理

吸取0.1mL血漿樣品于1.5mL具塞離心管，加入0.9mL乙腈，渦旋1min,混勻后15000r/min冷凍離心10min，取上清液溶液過0.22μm有機(jī)系濾膜進(jìn)樣。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

(1)色譜柱：HILLIC柱 (2.1×150mm，1.8μm)或柱效相當(dāng)?shù)纳V柱；

(2)流動相：流動相A(0.1%甲酸水)，流動相B(乙腈)，梯度洗脫；梯度洗脫程序?yàn)椋?～2min，10%A；2～3min，10%～50% A；3～5min，50% A；5～7min，10% A；7～8.00min，10% A

(3)流速：0.3 mL/min

(4)柱溫：35℃

(5)進(jìn)樣量：10 μL

1.3.2 質(zhì)譜條件

(1)離子源：電噴霧離子源(ESI)

(2)掃描方式：正離子掃描

(3)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)

(4)干燥氣溫度：350 ℃

(5)干燥氣流速：10 L/min

(6)霧化器壓力；40 psi

(7)毛細(xì)管電壓：3000V

(8)根據(jù)儀器優(yōu)化碰撞電壓及定性定量離子對、保留時間及碰撞能量等參數(shù)如表1所示。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、純水-甲醇、純水-乙腈體系下腺苷的峰形和靈敏度，結(jié)果表明0.1%甲酸水-乙腈條件下峰形好，靈敏度高。將濃度為1.0μg/mL腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在正、負(fù)模式下進(jìn)行掃描，結(jié)果腺苷在正模式下響應(yīng)較負(fù)離子模式更為穩(wěn)定，因此選擇正模式作為質(zhì)譜的離子化模式，選擇掃描方式為正離子掃描。再用濃度為1.0μg/mL腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的傳輸電壓、碰撞能等參數(shù)。優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測條件如表1所示。腺苷在正模式下，在ES+條件下一級質(zhì)譜掃描得到[M+H]+分子離子峰，即選取m/z 268為分子離子，在不同碰撞電壓下，對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，最終選擇m/z 119為定性離子，m/z 136為定量離子。腺苷二級質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖1腺苷結(jié)構(gòu)式圖2腺苷二級質(zhì)譜圖

圖3m/z136定量離子MRM色譜圖

圖4m/z119定性離子MRM色譜圖

2.2 色譜條件條件優(yōu)化

腺苷是以核苷和嘌呤為基本構(gòu)造的活性物質(zhì)，是一種天然核苷酸，分子極性較強(qiáng)[5，8]。本實(shí)驗(yàn)在參考其他文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上，比較了C18、HILIC及SCX三種不同型號色譜柱。腺苷由于極性較強(qiáng)，在C18和離子交換柱都不保留，在極性HILLIC柱上保留且峰形對稱，因此最終本實(shí)驗(yàn)選擇了waters HILLIC柱 (2.1×150mm，1.8μm)作為分離色譜柱。m/z 136定量離子和m/z 119定性離子MRM色譜圖如圖3、圖4所示。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化選擇

目前，腺苷的檢驗(yàn)方法有液相液質(zhì)等[9，10]，提取溶劑多為甲醇、甲醇-水等溶劑，但是文獻(xiàn)中檢測對象多為中藥，中藥中腺苷含量比血清中含量要大得多，因此多采用液相檢測方法。本實(shí)驗(yàn)研究對象為血清，與一般樣品分析差異較大，特別是前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，血清中主要成分為血漿蛋白、脂肪和碳水化合物等， 需要在前處理過程中盡可能除去這些物質(zhì)，否則就會影響腺苷在電噴霧過程中的離子化效率，形成基質(zhì)效應(yīng)，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文通過比較甲醇、乙腈的提取效果，最終選擇了乙腈作為提取溶劑，乙腈蛋白沉淀效果較甲醇更好，且經(jīng)過冷凍離心后，能夠有效去除干擾組分，同時因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選擇的是HILLIC柱，根據(jù)該極性柱的使用方法，流動相中有機(jī)相占的比例較大，本實(shí)驗(yàn)乙腈初始流動相比例為90%，與樣品最終提取液中乙腈濃度相同，不需要氮吹且沒有溶劑效應(yīng)，縮短了檢驗(yàn)時間，本方法前處理過程簡便快捷，選擇性好，回收率高，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室血清中腺苷含量大量、快速分析檢測的需求。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

配制濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化好的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測分析，以腺苷定量離子的峰面積為y軸，腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液所對應(yīng)的濃度為x軸，繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5.0～100μg/L范圍內(nèi)，腺苷的定量離子的峰面積和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：y=172.3x-1522，相關(guān)系數(shù)為0.998。一般情況下方法檢出限( LOD)是以空白基質(zhì)添加腺苷，進(jìn)行測定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)本實(shí)驗(yàn)方法的檢出限為5.0μg/L。

2.5 方法的回收率與精密度

分別準(zhǔn)確稱取6組不同血清樣品，并添加5.0μg/L和20.0μg/L腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 不同油樣添加回收率及精密度

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血清中腺苷含量，前處理方法方便快捷，選擇性好，回收率高，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室大量、快速分析血清中腺苷含量的檢測，也可用于血清中腺苷濃度監(jiān)測研究，為臨床檢驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。