協(xié)同刺激分子B7-H4在食管癌前病變組織中的表達(dá)及臨床意義

陳欣然，宋永志，單保恩*

（1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊050011；2. 河北省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所情報(bào)研究室，河北 石家莊 050021；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011）

食管癌發(fā)病率和死亡率分別居癌癥的第8和第6位[1]。中國(guó)食管癌發(fā)病率高于世界平均水平，死亡人數(shù)占全球該病死亡人數(shù)的50%以上[2]。食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squmous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌。在我國(guó)，超過(guò)90%的食管癌患者為ESCC[2]。由于絕大多數(shù)ESCC患者確診時(shí)已是中晚期，無(wú)明顯有效的干預(yù)手段，治療效果和預(yù)后都較差，5年生存期不足20%[3]。

ESCC的形成需要經(jīng)上皮不典型增生、原位癌和浸潤(rùn)性癌的過(guò)程。根據(jù)病變程度的不同，上皮不典型增生分為輕度、中度和重度。2010年世界衛(wèi)生組織分類(lèi)學(xué)大會(huì)上，“上皮內(nèi)瘤變”首次用于定義不典型增生和原位癌[4]。食管癌前病變可分為低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(low-grade intraepithelial neoplasia，LGIN)和高級(jí)別上皮內(nèi) 瘤 變 (high-grade intraepithelial neoplasia， HGIN)。LGIN包括了輕度和中度不典型增生，而HGIN包括了重度不典型增生和原位癌。食管癌前病變包括了ESCC形成的整個(gè)過(guò)程，但尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。在食管癌前病變階段給予恰當(dāng)?shù)脑\斷和治療，治療效果可顯著提高[5]。因此研究ESCC的發(fā)病機(jī)制，尋找用于診斷和治療食管癌前病變的生物標(biāo)志物，對(duì)于降低ESCC的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。

B7家族主要由協(xié)同刺激分子組成，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答和免疫逃逸中起著不可替代的作用。近年來(lái)，在B7家族中，除了經(jīng)典的B7.1和B7.2，又發(fā)現(xiàn)了一些新的協(xié)同刺激分子，包括B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-DC和B7-H6[6]。B7-H4是在2003年由3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)，并分別命名為B7-H4、B7s1和B7x[7]。 B 7-H4基因在人體組織廣泛表達(dá)，但其蛋白僅在一些腫瘤組織表達(dá)，如肺癌、卵巢癌、前列腺癌、黑色素瘤、胃癌和乳腺癌，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)[8]。B7-H4在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有表達(dá)[9]，在細(xì)胞膜表達(dá)的B7-H4主要通過(guò)抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[8]，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的B7-H4可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤形成[10]，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤形成起著重要作用[11]。白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素10(in terleukin-10，IL-10)和干擾素γ(in terferon-γ， IFN-γ)是腫瘤微環(huán)境中常見(jiàn)的細(xì)胞因子，通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答或誘導(dǎo)免疫耐受從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。IL-6可通過(guò)活化STAT3信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展[12]。IL-10對(duì)抗腫瘤免疫應(yīng)答起著雙向調(diào)節(jié)作用[13]。而IFN-γ是Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有明顯抗腫瘤作用[14]。本文通過(guò)研究B7-H4在食管癌前病變組織的表達(dá)特點(diǎn)，分析其與病變組織中細(xì)胞因子IL-6、IL-10和IFN-γ表達(dá)的相關(guān)性，探討B(tài)7-H4在食管癌前病變進(jìn)程中發(fā)揮的作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑，購(gòu)于北京中杉金橋公司；PCR引物，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Total RNA提取試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Promega公司；SYBR-Green qPCR試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；總蛋白提取試劑盒，購(gòu)于北京索萊寶科技公司；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)于上海捷瑞生物科技公司；兔抗人B7-H4單抗，購(gòu)于美國(guó)GeneTex公司；兔抗人 β-actin單抗，購(gòu)于美國(guó)Rockland公司；羊抗兔熒光二抗，辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔二抗，購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。IL-6、IL-10和IFN-γ ELISA試劑盒，購(gòu)于Abcam公司。

1.2 組織標(biāo)本

選取2015年5月至2017年1月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行食管內(nèi)鏡診斷或治療的患者58例，收集內(nèi)鏡切除的食管組織標(biāo)本58例。其中正常組織16例，LGIN 23例，HGIN 19例?；颊吣行?1例，女性17例，年齡39~85歲，中位年齡59歲。所有患者內(nèi)鏡切除食管組織前均未接受化療、放療或生物治療。組織標(biāo)本分為3部分，離體15 min內(nèi)分別置于4%多聚甲醛、RNA儲(chǔ)存液和液氮中，保存?zhèn)溆谩Ｋ袑?shí)驗(yàn)研究均得到患者及家屬的知情同意，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 HE染色

取在4%多聚甲醛中保存的組織標(biāo)本，經(jīng)95%乙醇溶液和二甲苯脫水透明后，石蠟包埋，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察食管組織的病變特征。

1.4 免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)B7-H4蛋白表達(dá)

將組織切片高壓熱修復(fù)后，滴加兔抗人B7-H4單抗(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。滴加牛血清白蛋白封閉液，37 ℃封閉45 min。滴加辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔二抗，37 ℃孵育60 min。DAB顯色劑顯色，中性樹(shù)膠封固。B7-H4表達(dá)評(píng)分以陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度相乘為最終得分[15]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)B7-H4 mRNA表達(dá)

取RNA儲(chǔ)存液中保存的組織標(biāo)本，采用低溫勻漿和Trizol試劑提取食管組織中的總RNA，按qPCR說(shuō)明書(shū)的操作步驟合成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GAPDH引物序列：上游5′-GTCAACGGATTTGGTCGTA TTG-3′， 下 游5′-C A TGGGTGGAATCATATTGGAA-3′；B7-H4引 物序 列：上 游5′-TATTAGCAGCCGCTCTGT GC-3′， 下 游5′-T C AGGATTCCATCCTCCCCA-3′。 擴(kuò)增時(shí)95 ℃預(yù)變性10 min，45個(gè)循環(huán)的參數(shù)為：95 ℃，15 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s。 G APDH為內(nèi)參對(duì)照基因，用2-??CT法評(píng)價(jià)B7-H4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量[16]。

1.6 Western blot法檢測(cè)B7-H4蛋白表達(dá)

取液氮中保存的組織標(biāo)本，RIPA裂解液提取總蛋白。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取蛋白溶液，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，再分別放入 β-actin(1∶5 000稀釋)和B7-H4(1∶1 000稀釋)的單克隆抗體中，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后，加入羊抗兔熒光二抗，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次，熒光掃描分析。

1.7 ELISA檢測(cè)IL-6、IL-10和IFN-γ蛋白表達(dá)

將1.6實(shí)驗(yàn)中得到的蛋白溶液，按BCA方法進(jìn)行蛋白定量后，用生理鹽水稀釋成5 μg/μL蛋白溶液。每次檢測(cè)取稀釋后的蛋白溶液40 μL。操作步驟按IL-6、IL-10和IFN-γ試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析均-采 用Graphpad Prism 5.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。定量數(shù)據(jù)以x± s 。用Spearman相關(guān)分析和Pearson相關(guān)分析不同參數(shù)間的相關(guān)性，用One-way ANOVA法比較不同指標(biāo)在兩組或多組間的差異，以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 食管組織病理學(xué)觀(guān)察結(jié)果

正常和食管癌前病變組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖1，正常食管組織，上皮細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核大小正常，細(xì)胞有正常極向。LGIN組織表現(xiàn)為基底層增厚，上皮層下1/2細(xì)胞失去極向，核增大。HGIN組織表現(xiàn)為基底層進(jìn)一步增厚，上皮層超過(guò)1/2至全部細(xì)胞失去極向，異型明顯，核增大，核深染。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，B7-H4蛋白主要在食管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)，在細(xì)胞核基本不表達(dá)(圖2)。58例食管組織中，B7-H4蛋白低表達(dá)者46例，表達(dá)率為79.3%；B7-H4高表達(dá)者12例，表達(dá)率為20.7%。在正常食管組織、LGIN組織、HGIN組織中B7-H4蛋白高表達(dá)率僅分別為6.25%、8.70%和47.4%。相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表1，B7-H4表達(dá)與食管組織病理分級(jí)呈顯著正相關(guān)，而與患者性別和年齡無(wú)明顯相關(guān)性。

圖1 正 常和食管癌前病變組織HE染色結(jié)果的觀(guān)察(× 400)

圖2 免 疫組織化學(xué)染色評(píng)價(jià) B 7-H4在 食管組織的表達(dá)(× 4 00)

表1 食 管組織 B 7-H4表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

2.2 食管組織B7-H4 mRNA和蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步研究B7-H4分子在食管組織的表達(dá)，我們檢測(cè)了食管組織B7-H4 mRNA和蛋白的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示，正常食管組織和食管癌前病變組織均表達(dá)B7-H4 mRNA，B7-H4 mRNA在16例正常、23例LGIN和19例HGIN組織的相對(duì)表達(dá)量分別為0.001 1 ±0.000 5、0.001 3±0.000 7和0.001 1±0.000 7(圖3A)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，B7-H4 mRNA在正常食管組織和食管癌前病變組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。

Western blot結(jié)果如圖3B，16例正常食管組織、23例LGIN和19例HGIN組織B7-H4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.11、0.21±0.09和0.30±0.16。正常食管組織表達(dá)較少，而LGIN和HGIN組織B7-H4蛋白表達(dá)逐漸提高。與正常食管組織相比，B7-H4蛋白在HGIN組織表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

A：B7-H4 mRNA在食管組織的表達(dá)；B：B7-H4蛋白在食管組織的表達(dá). Normal：正常食管組織；LGIN：低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；HGIN：高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變.

上述結(jié)果提示，隨著食管組織病變程度的提高，B7-H4蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)。B7-H4可能參與或促進(jìn)了食管癌前病變的形成。

2.3 B7-H4與細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)果如圖4所示，正常食管組織、LGIN和HGIN組織中IL-6水平逐漸升高，分別為(78.7±43.8)、(150.4±105.5)、(206.0±68.3) μg/mL。與正常組織相比，LGIN和HGIN食管組織IL-6水平均顯著提高(P< 0.05或 P<0.01)。另外，與正常食管組織相比，HGIN組織IL-10濃度也顯著提高(P<0.05)。正常食管組織、LGIN和HGIN組織IFN-γ 濃度分別為(45.1±17.0)、(48.9±15.7)、(46.5±22.4) μg/mL。與正常食管組織IFN-γ濃度相比，LGIN和HGIN組織IFN-γ濃度均無(wú)顯著改變， P 均>0.05。上述結(jié)果提示，食管癌前病變進(jìn)程中IL-6 和IL-10表達(dá)上調(diào)，這兩種細(xì)胞因子可能促進(jìn)了食管癌前病變進(jìn)程。

B7-H4與細(xì)胞因子表達(dá)之間的相關(guān)性結(jié)果如圖4D~F所示，B7-H4表達(dá)與IL-6濃度呈顯著正相關(guān)(r= 0.469 0， P<0.05)。而B(niǎo)7-H4表達(dá)與IL-10和IFN-γ濃度無(wú)明顯相關(guān)性， P值分別為0.941 3和0.831 4。上述結(jié)果提示，在食管癌前病變進(jìn)程中，B7-H4與IL-6表達(dá)呈顯著正相關(guān)，B7-H4可能是通過(guò)與IL-6相互作用參與或促進(jìn)了食管癌前病變進(jìn)程。

3 討 論

圖4 IL-6 、 IL -10 和 IF N-γ 在食管組織蛋白溶液中的含量及其與 B 7-H4表達(dá)的相關(guān)性

本研究顯示，隨著食管癌前病變級(jí)別的提高，B7-H4蛋白表達(dá)顯著提高，而B(niǎo)7-H4 mRNA表達(dá)無(wú)顯著性差異。其可能的原因，一方面，食管上皮細(xì)胞癌變過(guò)程中，B7-H4轉(zhuǎn)錄異?？赡苁瞧涓弑磉_(dá)的重要原因，而調(diào)控B7-H4分子轉(zhuǎn)錄的相關(guān)因子可能與B7-H4促進(jìn)食管上皮細(xì)胞癌變有關(guān)；另一方面，也可能因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)樣本數(shù)較少，標(biāo)準(zhǔn)差較大。因此，食管癌前病變進(jìn)程中B7-H4 mRNA表達(dá)變化及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在食管組織的浸潤(rùn)，結(jié)果顯示，在食管上皮組織3種淋巴細(xì)胞均無(wú)明顯浸潤(rùn)，提示B7-H4分子可能不是直接作用于淋巴細(xì)胞而促進(jìn)食管癌前病變進(jìn)程的。為進(jìn)一步研究B7-H4促進(jìn)食管癌前病變的作用及機(jī)制，本研究分析了B7-H4表達(dá)與細(xì)胞因子的關(guān)系。

IL-6是一種促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的細(xì)胞因子，其作為檢測(cè)惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，靈敏度和特異性分別達(dá)到60%~70%和58%~90%[17-18]。IL-6可通過(guò)與其受體結(jié)合，活化STAT3信號(hào)通路，激活一系列下游蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。另外，IL-6在腫瘤發(fā)展過(guò)程中能促進(jìn)非癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤干細(xì)胞[11]。有研究顯示STAT3與B7-H4上游啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合，通過(guò)IL-6/STAT3/B7-H4通路調(diào)控B7-H4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)[19]。在本研究中，與正常食管組織相比，IL-6 在LGIN和HGIN組織中的表達(dá)顯著升高。而且，B7-H4與IL-6表達(dá)呈顯著正相關(guān)。由此，我們推測(cè)，B7-H4可能是通過(guò)與IL-6作用促進(jìn)了ESCC的形成。

IL-10是對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有雙向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[15]。一方面，IL-10可以通過(guò)抑制抗原提呈功能、抑制T細(xì)胞的活化和免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抑制因子等作用誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。另一方面，IL-10還可以直接或間接活化NK細(xì)胞和腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞，提高NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，從而提高機(jī)體腫瘤殺傷效應(yīng)，抑制腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。在本研究中，與正常食管組織相比，HGIN組織IL-10表達(dá)顯著升高。但是，IL-10與B7-H4表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性。這一結(jié)果提示，IL-10可能參與了食管癌前病變進(jìn)程，但其可能與B7-H4促進(jìn)ESCC形成無(wú)關(guān)。

IFN-γ 是 Ⅱ型干擾素，又稱(chēng)免疫干擾素，主要由活化的Th0、Th1和幾乎所有的CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用[16]。在本研究中，IFN-γ在正常食管組織、LGIN和HGIN食管組織表達(dá)均很低，且無(wú)顯著性差異，且B7-H4與IFN-γ的表達(dá)也無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)果提示，B7-H4促進(jìn)食管癌前病變進(jìn)程可能與IFN-γ無(wú)關(guān)。

綜上所述，協(xié)同刺激分子B7-H4可能作為一個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，通過(guò)與IL-6作用參與或促進(jìn)了食管癌前病變的進(jìn)程，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。