閆 冬,吳怡嫻,董娟娟,李秀梅,封 敏*
(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊830011;2. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830011;3. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)
食管癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失調(diào)的結(jié)果,Survivin、c-myc在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中表達(dá)上調(diào),但Survivin、c-myc共同高表達(dá)的機(jī)制并不十分清楚,在前期試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)Survivin通過(guò)調(diào)控核因子(nuclear Factor-κB ,NF-κB)的上游關(guān)鍵激酶IKK激酶(IκB kinase)的轉(zhuǎn)錄而影響NF-κB蛋白的活化狀態(tài)[1],充分說(shuō)明在腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中,Survivin是一個(gè)潛在的調(diào)控分子。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子,在正常組織中低表達(dá), c -myc是 原癌基因,其異常擴(kuò)增及點(diǎn)突變可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分裂增值。在哈薩克族食管癌組織中Survivin高表達(dá)與cmyc表達(dá)正相關(guān), c- myc基 因表達(dá)調(diào)控與ERK信號(hào)通路相關(guān)[2]。Survivin調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的功能研究較為透徹,但其作為一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在信號(hào)通路中的作用并不清楚,鑒于此我們推測(cè)Survivin作為潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可能對(duì)c-myc具有調(diào)控作用。故本實(shí)驗(yàn)采用shRNA技術(shù)沉默食管癌ECA109細(xì)胞中Survivin的表達(dá)后觀察c-myc及ERK激酶活化蛋白的表達(dá)變化,初步探討Survivin對(duì)c-myc的調(diào)控作用。
食管癌ECA109細(xì)胞系由新疆醫(yī)科大學(xué)科研中心提供,Survivin短發(fā)夾RNA質(zhì)粒(Survivin shRNA plasmid)、陰性短發(fā)夾RNA質(zhì)粒(control shRNA plasmid)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(shRNA plasmid transfection reagent),均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司;ERK信號(hào)通路阻斷劑PD98059、p38信號(hào)通路阻斷劑SB203580、PI3K信號(hào)通路阻斷劑LY294002、JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SP600125、JAK阻斷劑AG490均購(gòu)于德國(guó)Sigma公司,兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體、羊抗兔IgG抗體均購(gòu)于武漢博士德公司,PCR擴(kuò)增引物購(gòu)于上海生物工程有限公司。PCR引物序列、產(chǎn)物片段長(zhǎng)度及退火溫度如表1。
表1 PCR引物序列、產(chǎn)物片段長(zhǎng)度及反應(yīng)條件
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌ECA109細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清以及100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 shRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 分為Survivin shRNA干擾組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組、空白細(xì)胞株(未加任何處理的食管癌ECA109細(xì)胞),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將2 μg Survivin shRNA plasmid和4 μL shRNA plasmid transfection reagent分別用100 μL無(wú)血清DMEM 稀釋,5 min后將稀釋好的Survivin shRNA和shRNA plasmid transfection reagent混勻,室溫放置30 min備用。陰性質(zhì)粒制備方法同前。將轉(zhuǎn)染混合物緩慢的逐滴加入食管癌ECA109細(xì)胞中,輕輕晃動(dòng),放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育24 h后,用5 μg/μL的嘌呤霉素篩選細(xì)胞株,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
1.2.3 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR收集各組細(xì)胞,采用Trizol試劑一步法提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度。以提取的總RNA為模板,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL,其中cDNA模板2 μL,待擴(kuò)增基因上下引物各1 μL,即用型PCR反應(yīng)試劑盒反應(yīng)溶液(2倍濃度)10 μL,雙蒸水6 μL,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀成像分析。
1.2.4 Western blot檢測(cè) 收集細(xì)胞、加入RIPA裂解緩沖液,冰上裂解30 min,低溫離心,取上清分裝,BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性,把蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),電壓100 V,時(shí)間90~120 min。然后轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(兔抗人Survivin、兔抗人c-myc抗體,1∶400),二抗孵育(羊抗兔IgG抗體,1∶400),X光曝光成像,Quantity One軟件分析目標(biāo)。
1.2.5 信號(hào)通路抑制劑的配置及分組 將PD98059、SB203580、LY294002、SP600125、AG490干粉充分溶解于DMSO溶液中,配制成1 mg/mL的儲(chǔ)存液,于-20℃冰箱保存,使用前稀釋成指定的濃度。待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度為70%~80%時(shí),更換為含0.1% FBS的1640培養(yǎng)基24 h使細(xì)胞同步化,根據(jù)分組情況分別加入干預(yù)劑,終濃度為50 μmol/L,24 h后收集細(xì)胞。
- 采 用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以x± s 表 示,各基因的組間比較采用t 檢驗(yàn);基因間表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān);以 α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
Survivin shRNA轉(zhuǎn)染48 h,Survivin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),與陰性質(zhì)粒對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01);c-myc mRNA及蛋白表達(dá)受到抑制,表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、圖2、表2、表3。
圖1 RT-PCR 法 檢測(cè)各組 S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達(dá)
圖2 Western blot法 檢測(cè)各組S urvivin 和 c- myc 蛋白的表達(dá)
表2 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc mRNA 的表達(dá)變化
表3 Survivin shRNA 干 擾后各組S urvivin 和 c-myc 蛋白的表達(dá)變化
各信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑PD98059、SB203580、 LY294002、 SP600125、 AG490作 用 24 h后,PD98059抑制劑組 c- myc基 因的表達(dá)明顯降低,與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各組未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖3和表3。
圖3 信 號(hào)通路抑制劑干預(yù)組 c- myc的表達(dá)
表 信號(hào)通路抑制劑干預(yù)組 的表達(dá)
Western blot電泳結(jié)果顯示,Survivin shRNA轉(zhuǎn)染后48 h,與空白對(duì)照組(1.59±0.28)和陰性質(zhì)粒對(duì)照組(1.63±0.87)比較,p-ERK蛋白磷酸化水平(0.87±0.46)明顯降低,差異顯著(P<0.05),提示ERK蛋白活化抑制(見(jiàn)圖4)。
圖4 Survivin shRNA 干擾ERK蛋白磷酸化的表達(dá)
本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在哈薩克族食管癌組織中Survivin與c-myc表達(dá)明顯上調(diào),且二者的表達(dá)呈正相關(guān),提示Survivin、c-myc可能協(xié)同發(fā)揮作用,促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和抑制細(xì)胞凋亡。Survivin和c-myc這種協(xié)同表達(dá)現(xiàn)象也見(jiàn)于其他腫瘤中[3-4],但機(jī)制并不清楚。
RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種由內(nèi)源性或外源性的雙鏈RNA分子(double s trand RNA,dsRNA)介導(dǎo),特異性降解相應(yīng)序列的mRNA,阻斷或降低同源基因表達(dá),產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失現(xiàn)象,RNAi是生物界普遍存在的一種調(diào)控基因表達(dá)的有效方式和鑒定基因功能的重要手段。利用RNAi技術(shù)可以容易地確定復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)基因的上下游關(guān)系及其作用,因此成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途經(jīng)[5]。我們將Survivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞株48 h后,Survivin mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào),c-myc mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低,提示在食管癌ECA109細(xì)胞內(nèi)Survivin具有調(diào)控 c- myc基 因表達(dá)的作用。在多種腫瘤組織中Survivin與c-myc表達(dá)具有一致性,在腫瘤中可能起協(xié)同作用,我們推測(cè)高表達(dá)的Survivin可通過(guò)調(diào)控作用激活c-myc表達(dá),而c-myc過(guò)度表達(dá)可以直接激活CDK4、cyclin D/E/A、細(xì)胞分裂周期25A等細(xì)胞周期基因的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、分裂[6-7]。采用shRNA技術(shù)下調(diào)Survivin表達(dá)后,其對(duì)c-myc激活的作用消失或減弱,從而c-myc的表達(dá)也明顯下調(diào),呈現(xiàn)一致性。
ERK通路、JNK通路、p38通路 和 JAK/STAT通路、PI3K通路是目前研究較多的將細(xì)胞表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后都能作用于轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)特定的基因表達(dá)。我們采用ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑PD98059、p38信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SB203580、JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路特異阻斷劑SP600125、PI3K的特異阻斷劑LY294002,JAK化學(xué)阻斷劑AG490分別阻斷了ERK、p38、JNK、PI3K、JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵激酶ERK、p38、JNK、PI3K、STAT3的活化,RT-PCR、Western-blot結(jié)果顯示PD98059抑制劑組c-myc mRNA和蛋白的表達(dá)降低,與空白細(xì)胞組相比差異顯著,提示 c- myc是 ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游靶基因。ERK通路是MAPK家族的經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一[8-10],在腫瘤細(xì)胞凋亡、分化、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。ERK包括ERK1和ERK2兩種異構(gòu)體,其活性形式是磷酸化ERK(p-ERK),在受到如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子激素、絲裂原受體和缺氧等刺激時(shí),ERK發(fā)生磷酸化,并從胞漿移位至細(xì)胞核作用于c-myc、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子,促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),從而誘發(fā)多種癌基因的相繼激活,導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,在肝細(xì)胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)[11]上調(diào)癌細(xì)胞內(nèi)Ras-ERK通路的磷酸化水平,癌基因 c -myc表 達(dá)增加,我們?cè)囼?yàn)結(jié)果再次證實(shí)了c-myc的表達(dá)受ERK的調(diào)控。Survivin對(duì) c- myc這 個(gè)癌基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平具有正向調(diào)控作用,而c-myc的表達(dá)受ERK的調(diào)控,故我們進(jìn)一步檢測(cè)了Survivin shRNA沉默下調(diào)Survivin后ERK磷酸化的蛋白水平,發(fā)現(xiàn)p-ERK活化受到抑制,提示Survivin對(duì)c-myc的調(diào)控作用可能與ERK信號(hào)通路有關(guān),ERK蛋白的活化狀態(tài)是ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵點(diǎn),目前多種腫瘤藥物都是以信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶為靶點(diǎn),從而阻斷其誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。Survivin作為多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的下游效應(yīng)分子[12-13],其高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制,腫瘤細(xì)胞異常增殖,但其作為調(diào)控因子的研究并不多見(jiàn),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)可以影響ERK磷酸化水平,提示在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,基因與信號(hào)通路的關(guān)系可能不單單是一種單向調(diào)節(jié)的作用,高表達(dá)的Survivin可能通過(guò)影響ERK磷酸化水平從而調(diào)節(jié)其下游靶基因 c-myc的 表達(dá)水平?;蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)龐大、作用復(fù)雜的系統(tǒng),我們的研究?jī)H僅證實(shí)了Survivin具有影響ERK磷酸化的作用,但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。