番瀉葉中番瀉苷A、B的穩(wěn)定性探究

胡 軍，畢海林，楊 敬，蘇 玲，肖裕章，潘 瑤，唐建華

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，重慶榮昌402460 ； 2.重慶方通動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶榮昌402460)

番瀉葉具有通便導(dǎo)滯，泄熱利水之功效，主治熱結(jié)積滯與便秘腹痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番瀉葉瀉下的主要成分為番瀉苷類，而其中又以番瀉苷A、B為主。哈飛和陳丹丹等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)番瀉苷對(duì)熱不穩(wěn)定，不能長(zhǎng)時(shí)間加熱。故番瀉苷隨著溫度的改變可能會(huì)對(duì)番瀉葉顆粒劑等相關(guān)制劑的質(zhì)量產(chǎn)生較大影響。為探究番瀉苷A、B在制備過(guò)程中的穩(wěn)定性，本試驗(yàn)以番瀉苷A、B的含量變化作為指標(biāo)，考察不同條件下番瀉苷A、B的降解情況，為番瀉葉顆粒劑的研制與生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器和藥品

1.1 儀器 PE2000型高效液相色譜儀(依力特公司)；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；AB135-S型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 藥品 番瀉葉藥材，購(gòu)自安徽省亳州市德昌藥業(yè)有限公司，經(jīng)新疆藥物研究所鑒定為豆科灌木植物狹葉番瀉葉Cassia angustifolia vahl的干燥小葉；對(duì)照品番瀉苷A(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110824—201301)、番瀉苷B(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110825—201502)；甲醇和乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 番瀉苷A和番瀉苷B分析方法的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取番瀉苷A﹑番瀉苷B對(duì)照品適量，置于50 mL的棕色量瓶中，加50%甲醇至溶解完全，定容至刻度，制成含番瀉苷A 53.9 μg/mL、番瀉苷B 91.9 μg/mL的混合溶液，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取番瀉葉粉0.5 g，置50 mL量瓶中，用50%甲醇溶解，超聲處理30 min，放冷，定容，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 Ultimate XB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈:5 mmol/L四庚基溴化銨的醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH值=5)(35∶65)；柱溫40 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm。該色譜條件下番瀉苷A、B分離度良好，對(duì)照品及供試品的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 番瀉苷A、B混合對(duì)照品(a)，供試品(b)的色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 用50%甲醇配制質(zhì)量濃度為2.42、4.85、9.69、19.38、38.76、77.52 μg/mL和155.04 μg/mL番瀉苷A及2.95、5.91、11.83、23.65、47.30、96.40 μg/mL和189.20 μg/mL番瀉苷B系列對(duì)照品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：番瀉苷AY=10 964X+40 111(R=0.999 9)；番瀉苷BY=11 227X+15 105(R=0.999 9)，表明番瀉苷A、B分別在2.42～155.04 μg/mL及2.95～189.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn) 精密吸取番瀉苷A、B對(duì)照品溶液各6份，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，得番瀉苷A峰面積RSD值為1.06%，番瀉苷B峰面積RSD值為0.87%，均小于2%(n=6)，表明所選用的儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下制備對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果顯示,番瀉苷A峰面積RSD值為1.71%，番瀉苷B峰面積RSD值為1.22%，表明對(duì)照品溶液在該檢測(cè)系統(tǒng)和方法下，8 h內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，得番瀉苷A供試品溶液濃度為19.38 μg/mL，番瀉苷B供試品溶液濃度為47.30 μg/mL，以供試品溶液的濃度為初始濃度。取適量番瀉苷A、B對(duì)照品于10 mL量瓶中，用供試品溶液溶解并定容，使加入的濃度約為初始濃度的80%、100%和120%，每一濃度進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均回收率。所得平均回收率番瀉苷A為98.92%，RSD值為1.03%；番瀉苷B為98.90%，RSD值為0.73%，結(jié)果見(jiàn)表1。

初始濃度/μg/mL加入量/μg加入濃度/μg/mL測(cè)得濃度/μg/mL回收率/%RSD/%番瀉苷A19.38148.20±1.3714.82±0.1434.01±0.3398.73±1.39214.86±3.0521.49±0.3140.71±0.5999.26±1.34240.72±1.2824.07±0.1343.15±0.2098.77±0.431.03番瀉苷B47.30391.74±2.1139.18±0.2186.26±0.2599.45±0.95494.32±3.4049.43±0.3496.03±0.3298.57±0.21553.30±5.0655.33±0.51101.89±0.2298.68±0.690.73

2.2 經(jīng)典恒溫加速試驗(yàn) 精密稱取1 mg番瀉苷A和B，分別用50%乙醇、50%甲醇、0.1%碳酸氫鈉和水充分溶解再密封于安瓿瓶中，將每個(gè)溶劑的安瓿瓶分為4組，分別放入50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃的恒溫水浴鍋中，即刻起記為0 h，恒溫加熱，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，溶液過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以0 h為100%，其他時(shí)間與0 h相比，計(jì)算藥物殘留百分率，以殘留率的自然對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，按lnCi=-kt/2.303+lnC0方程求得同一溫度、同一溶劑中的反應(yīng)常數(shù)k，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，溫度是影響番瀉苷A、B的主要因素，隨著溫度的升高，番瀉苷A、B的降解速率均增大，且番瀉苷B的降解速率大于番瀉苷A。根據(jù)Arrhenius公式求得同一溶劑的線性回歸方程及t0.9，并以溶劑為橫坐標(biāo)，lnk為縱坐標(biāo)對(duì)不同溶劑、不同溫度反應(yīng)常數(shù)的自然對(duì)數(shù)作圖，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表2 番瀉苷A、B的一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程反應(yīng)常數(shù)

表3 番瀉苷A、B的Arrhenius方程

圖2 番瀉苷A(A)和番瀉苷B(B)降解的溶劑速率圖

Ink:反應(yīng)常數(shù)的自然對(duì)數(shù)(Ink值越大，則番瀉苷的降解速率就越快)

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，番瀉苷A、B的k值逐漸上升，即溫度越高，番瀉苷A、B的穩(wěn)定性越差；不同溶媒之間進(jìn)行橫向比較，發(fā)現(xiàn)溶媒為50%乙醇和50%甲醇時(shí)，其k值低于溶媒為0.1%碳酸氫鈉和水的k值，故溶媒為50%乙醇和50%甲醇時(shí)，番瀉苷A、B的穩(wěn)定性較好。

2.3 番瀉苷A、B在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的穩(wěn)定性[3]選用30%、50%、70%和90%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為考察因素。稱取適量番瀉苷A和B加入上述溶劑中溶解，分裝于不同安瓿瓶中，熔封，置70 ℃±2 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行加速試驗(yàn)，于0、2、4、6、8 h時(shí)分別取樣20 μL，進(jìn)樣，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算番瀉苷A、B的百分殘留率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，在70 ℃水浴條件下，番瀉苷A、B在30%和50%乙醇中穩(wěn)定，而在70%和90%乙醇中均不穩(wěn)定，尤其在90%乙醇中最容易降解；番瀉苷B比番瀉苷A在高醇中更不穩(wěn)定，在70 ℃高溫條件下，加熱8 h，番瀉苷A在90%乙醇溶液中降解49.18%，而番瀉苷B則降解了88.13%。

3 討論

番瀉苷類化合物具有酚羥基和羧基，具有一定酸性，在堿水中成鹽而溶解，故可用碳酸氫鈉溶液溶解。此外，番瀉苷類化合物除了以游離酸的形式存在外，還以鈣鹽的形式大量存在于植物中，所以傳統(tǒng)方法中一般用水來(lái)提取番瀉苷。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，加醇有利于番瀉苷類化合物的溶出[5]。

圖3 在70 ℃下番瀉苷A(A)、番瀉苷B(B)在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中降解的殘留百分率

本試驗(yàn)通過(guò)經(jīng)典恒溫法考察番瀉苷A和番瀉苷B在不同溶劑、不同溫度和時(shí)間的穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)溫度是影響番瀉苷A、B穩(wěn)定性的主要因素，在高溫條件下，番瀉苷A和番瀉苷B易發(fā)生降解，且番瀉苷B的降解速率更快，這與于波濤等[5]的研究結(jié)果是一致的；此外，溶劑也會(huì)對(duì)番瀉苷A、B的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶媒為乙醇時(shí)，番瀉苷A、B的降解速率低于其他溶媒，通過(guò)番瀉苷A、B在不同濃度乙醇的穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)番瀉苷A、B在30%、50%等較低濃度乙醇(極性較大)中穩(wěn)定，在70%、90%等高醇(極性較小)中容易降解，且在90%乙醇中降解速率最快，由于高醇的極性低于低醇，故番瀉苷的穩(wěn)定性可能與溶媒的極性有關(guān)。此外，番瀉苷B降解速率比番瀉苷A更快，70 ℃水浴加熱8 h，番瀉苷B的降解速率是番瀉苷A的1.8倍。因此，在涉及番瀉葉相關(guān)制劑的制備工藝時(shí)，應(yīng)充分考慮其穩(wěn)定性。

除此之外，由Arrhenius方程可知：在溫度為70 ℃、溶媒為50%乙醇的條件下，番瀉苷A、B的半衰期分別為12.9 h和8.5 h，所以，提取、濃縮時(shí)選擇65 ℃±5 ℃較為適宜。