致仔豬腹瀉沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

劉 燕

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院牧業(yè)工程學院，河南中牟451450)

近幾年，隨著我國畜牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，豬的養(yǎng)殖數(shù)量逐漸增多，已經(jīng)形成了規(guī)?；B(yǎng)殖模式，在豬的養(yǎng)殖過程中，仔豬的腹瀉成為臨床中常見的疾病，其感染率和死亡率均較高，給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。仔豬腹瀉主要由傳染性病原感染以及非傳染性因素等引起，傳染性因素包括細菌、病毒以及其他病原的感染，其中以細菌引起的仔豬腹瀉在仔豬感染性腹瀉中占有較大比重，尤其致病性大腸桿菌和沙門菌引起的仔豬腹瀉臨床中為最常見[2]。沙門菌腸桿菌科一種革蘭陰性短桿菌，可以起動物及人發(fā)病，也是引起人們食物中毒的主要病原菌[3]。仔豬沙門菌病又稱仔豬副傷寒，是由沙門菌屬中的豬霍亂沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等不同血清型沙門菌引起的一種仔豬的傳染病，主要表現(xiàn)為敗血癥和壞死性腸炎，其中敗血型沙門菌可以引起仔豬黃色水樣腹瀉，結(jié)腸炎型沙門菌病可以引起彌散性壞死性結(jié)腸炎和盲腸炎[4-5]。沙門菌引起仔豬腹瀉問題日益嚴重，當發(fā)生該病時，應(yīng)進行藥敏試驗分析耐藥性，合理用藥，提高治療效果。 本試驗從中牟地區(qū)規(guī)?；酿B(yǎng)殖場采集患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物等樣品120份中。對分離得到57株沙門菌進行致病性和耐藥性分析，為該地區(qū)沙門菌引起仔豬腹瀉的防治提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來源 2017年4月份～2018年3月份，從中牟地區(qū)規(guī)模化的養(yǎng)殖場采集患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物等樣品120份，進行病原菌的檢測。

1.2 主要試劑及儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；腸桿菌科生化鑒定條、藥敏紙片，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DL-2000 Marker、2×TaqMarker Mix，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；細菌 DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；7%綿羊脫纖血液瓊脂培養(yǎng)由本實驗室自制，多功能梯度 PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal型)由美國 ABI 公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱由上海經(jīng)濟開發(fā)區(qū)沈蕩中新電器有限公司生產(chǎn)；常規(guī)的試劑及儀器由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 體重25±2 g左右昆明系小鼠290只，購自鄭州市實驗動物有限公司。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng) 將采集的患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物等樣品，加入無菌的PBS中，離心，取上清接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h～16 h，選取優(yōu)勢生長菌分別接種于BS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h～16 h后，挑取單個菌落接種普通培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后，革蘭染色觀察細菌形態(tài)，另外挑取純化培養(yǎng)的細菌接種營養(yǎng)肉湯中37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)12 h后，進行生化鑒定與藥敏試驗。

2.2 細菌的生化試驗鑒定 取純化的分離菌株接種于腸桿菌科生化鑒定條中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h后，用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)鑒定細菌的生化特性。

2.3 細菌的PCR鑒定 取純化的培養(yǎng)的分離菌株用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，參考文獻[6]設(shè)計沙門菌的特異性引物(表1)，對分離菌株進行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系與條件，2×TaqMix 12.5 μL，Primer Mix(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板各2 μL，ddH2O 補25 μL；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán) 35 次；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank中登錄參考基因序列進行同源性比較。

表1 引物序列

2.4 致病性試驗 調(diào)整分離菌株的菌液濃度為(108CFU/mL)，每株分離菌株通過灌胃的方式接種5只小鼠，接種劑量為0.25 mL，對照組給予等量的無菌的生理鹽水。攻毒12 h后，觀察7 d記錄每組的發(fā)病及死亡情況，對于死亡的小鼠剖檢進行細菌分離與鑒定。

2.5 藥敏試驗 分離菌株藥敏試驗按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行試驗操作和結(jié)果判斷。

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)與形態(tài)學觀察結(jié)果 采集的患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物等樣品，在血液瓊脂培養(yǎng)基上長出了白色、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；在 BS 瓊脂培養(yǎng)基上長出了黑色、光滑、有光澤的菌落；普通培養(yǎng)基上能長出光滑、圓形、灰白色、濕潤的小菌落。革蘭染色鏡檢可見無莢膜和芽孢、散在的革蘭陰性短桿菌。與報道沙門菌培養(yǎng)特性和形態(tài)特征一致，據(jù)統(tǒng)計120份樣品中分離到了57株沙門菌。

3.2 細菌生化特性鑒定結(jié)果 57株分離菌株能發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、枸櫞酸鹽，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵尿素、酵乳糖、蔗糖；吲哚試驗呈陰性，產(chǎn)生H2S；經(jīng)ATB自動生化儀鑒定為沙門菌，評定結(jié)果合格率在98.9%～99.9%之間，與報道沙門菌生化特性一致，3.3 細菌PCR鑒定結(jié)果 用沙門菌的特異性引物對分離菌株進行了PCR 鑒定，結(jié)果顯示，5株分離菌株均擴增出大約為184 bp左右的的目的條帶(見圖1)。分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的沙門菌株參考的序列同源性在98.9%～99.8%之間。證實57株分離菌株為沙門菌。

圖1 部分菌株P(guān)CR擴增與監(jiān)測結(jié)果

M:DL-2 000 Marker; 1-6:分離菌株； 7:空白對照

3.4 致病性試驗結(jié)果 在攻毒后的36 h～48 h，試驗小鼠出現(xiàn)精神沉郁，嚴重腹瀉，嚴重的出現(xiàn)死亡，對死亡的小鼠剖檢，無菌采集肝臟、脾臟等分離到了沙門菌，直到7 d試驗結(jié)束，對照組小鼠健康存活，據(jù)統(tǒng)計32株分離菌株對小鼠具有致病性。因而證實32株沙門菌為致病性菌株。

3.5 藥敏試驗結(jié)果 由表2可知，藥敏試驗結(jié)果顯示，32株致病性沙門菌對頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、恩諾沙星4種藥物耐藥性在25.0%～37.5之間；對氟苯尼考、阿米卡星、強力霉素、林可霉素、慶大霉素、多黏菌素、磺胺間甲氧嘧啶7種藥物耐藥性在40.6%～78.1%；對大觀霉素、新霉素、阿莫西林、青霉素、氨芐西林5種藥物耐藥性在87.5%～100%之間，且存在多重耐藥性。

表2 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果 (n=32)

4 討論

沙門菌在自然界分布廣泛，是一種人獸共患的條件性病原菌，可以引起多種家畜家禽及人發(fā)病，通過污染食品引起人們的食物中毒，也是引起腹瀉的重要病原菌之一[7]，沙門菌具有嚴格的宿主特異性，當仔豬感染沙門菌后，主要在仔豬的腸道內(nèi)進行生長繁殖，通過腸道上皮細胞進入仔豬的體內(nèi)，再通過血液循環(huán)進入全身的組織器官，進而導致全身感染，嚴重著出現(xiàn)菌血癥，并引起仔豬的腹瀉、發(fā)熱和腸道炎癥等癥狀。沙門菌主要傳染源為帶菌豬和病豬，并且?guī)Ьi和病豬可以長期帶毒和排毒，該菌可以通過接觸傳播和水平傳播兩種方式進行傳播，導致沙門病廣泛流行[8]。本試驗從中牟地區(qū)規(guī)?；酿B(yǎng)殖場采集患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物等樣品120份中分離鑒定了57株沙門菌，其中32株為致病性沙門菌，因而證實了該地區(qū)仔豬沙門菌感染嚴重，在該地區(qū)流行，應(yīng)引起重視。沙門菌為人獸共患的條件性病原菌，當飼養(yǎng)管理不善、環(huán)境條件變化等應(yīng)激因素，可以致使動物機體防衛(wèi)機能下降，引發(fā)該病的發(fā)生與流行，預防本病的同時應(yīng)該加強平時的飼養(yǎng)管理，提高機體的免疫力。

沙門菌腸桿科菌，具有血清型眾多易產(chǎn)生耐藥性特點，由于沙門菌耐藥機制發(fā)生改變，耐藥譜不斷擴大，耐藥性通過多種途徑在不同菌株之間傳播造成在不同菌株對抗生素產(chǎn)生嚴重的耐藥性，同時沙門菌可以傳播給人類，直接危害著人類的健康[9]。本試驗結(jié)果顯示，32株致病性沙門菌對頭孢曲松、頭孢他啶、環(huán)丙沙星等4種藥物耐藥性在25.0%～37.5%之間；對氟苯尼考、阿米卡星、強力霉素等7種藥物耐藥性在40.6%～78.1%之間；對大觀霉素、新霉素、阿莫西林等5種藥物耐藥性在87.5%～100%之間，且存在嚴重多重耐藥性。與陳如[2]、王偉[6]和姚明等[10]報道的仔豬沙門菌耐藥性存在一定的差異性。可能與沙門菌流行的地區(qū)和血清型有關(guān)，也與抗生素藥物的使用有關(guān)。當仔豬發(fā)生沙門菌病時，應(yīng)該進行了藥敏試驗分析，選擇敏感的藥物，交叉合理用藥，提高治療效果。同時注意環(huán)境的消毒。