脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠發(fā)生非酒精性脂肪肝

韓在祺，崔佰吉，馮 波，姚 璐

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

肝臟在調(diào)控糖脂代謝中發(fā)揮作用，通過合成和分解糖原以及糖異生途徑維持血糖平衡[1]。同時(shí)，肝臟是人體內(nèi)合成甘油三酯和膽固醇的主要器官，也是脂蛋白合成及組裝的場(chǎng)所，肝臟將合成的甘油三酯以脂蛋白的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，以此維持脂肪在機(jī)體內(nèi)的均衡分布[2]。非酒精性脂肪肝(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是一種典型的代謝性疾病，以肝臟脂肪代謝異常和脂肪堆積為特點(diǎn)[3]。目前，NAFLD已經(jīng)成為最常見的慢性肝臟疾病[4]。

Sirt6是Sirtuins家族的成員之一，定位于染色體，具有多種催化活性，包括：去乙?；?、去酰化和核糖基化等[5-7]。因此，Sirt6具有廣泛的底物基礎(chǔ)，能夠參與調(diào)控多種生理過程。雖然Sirt6基因敲除小鼠出生時(shí)表現(xiàn)正常，但是隨著生長(zhǎng)發(fā)育Sirt6基因敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)致死性的低血糖、淋巴球細(xì)胞明顯減少、皮下脂肪缺失和脊柱彎曲等缺陷，并在出生4周齡左右死亡，暗示Sirt6在調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝過程中具有不可忽視的作用[8]。基于此，我們構(gòu)建了脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠發(fā)生漸進(jìn)性肥胖[9]?？紤]到肥胖是誘發(fā)非酒精性脂肪肝的重要危險(xiǎn)因素，本試驗(yàn)通過探討脂肪組織特異性Sirt6基因敲除對(duì)小鼠肝臟的影響，以期可以進(jìn)一步明確脂肪組織Sirt6對(duì)肝臟糖脂代謝的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng) 脂肪組織特異性表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠(Fabp4-Cre)與Sirt6條件基因敲除小鼠(Sirt6-floxed)均由吉林醫(yī)藥學(xué)院保存和傳代，動(dòng)物統(tǒng)一編號(hào)，統(tǒng)一飼養(yǎng)。將Sirt6-floxed雜合小鼠與Fabp4-Cre小鼠交配的同時(shí)，將Sirt6-floxed雜合小鼠進(jìn)行自交，如此，可以獲得Sirt6floxed/floxed小鼠和Fabp4-Cre;Sirt6floxed/+小鼠。利用Sirt6floxed/floxed小鼠和Fabp4-Cre; Sirt6floxed/+小鼠交配，獲得的Fabp4-Cre;Sirt6floxed/floxed小鼠，即為脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠(Sirt6ad-/-小鼠)，獲得的Sirt6floxed/floxed小鼠，即為野生型對(duì)照小鼠。小鼠斷乳后，普通飼料飼養(yǎng)的小鼠即開始以正常飼料喂養(yǎng)。對(duì)于采用高脂飼料飼養(yǎng)的小鼠，從出生后的第五周齡開始采用高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料購(gòu)自Research Diets公司(D12492)。

1.2 Western Blotting檢測(cè) 分別取兩種基因型小鼠的肝臟、心臟、腎臟、棕色脂肪組織、肌肉、大腦、脾臟和白色脂肪組織。用加入蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解并使用勻漿器破碎組織后，低溫360°旋轉(zhuǎn)1h，4 ℃離心取上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝后-20 ℃保存。配置12% SDS-PAGE，對(duì)蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，選擇抗目標(biāo)蛋白的一抗孵育，洗膜，再孵育二抗，再洗膜，最后進(jìn)行顯影和分析。Western Blotting方法檢測(cè)Sirt6(1∶800)的表達(dá)，驗(yàn)證敲除效果，其中，Tubulin(1∶2 000)作為內(nèi)參蛋白。

1.3 組織病理學(xué)檢查 蘇木素-伊紅染色(H.E.染色)：輕柔分離目的組織后，在4%多聚甲醛溶液中固定約48 h后，依次經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟染色、脫水透明和封固等步驟后，使用光學(xué)顯微鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色：輕柔分離目的組織后，在4%多聚甲醛溶液中固定約48 h后，經(jīng)石蠟切片脫蠟和水化、抗原修復(fù)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、封閉、除去封閉液并加一抗(anti-CD68)孵育、PBS沖洗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染和封固后，使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 使用TRIZ試劑從兩種基因型小鼠的肝臟組織中分離純化總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成cDNA第一條鏈。利用基因特異性引物和SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液，使用實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)新合成的cDNA進(jìn)行分析測(cè)定。利用ΔΔCt循環(huán)閾值方法分析數(shù)據(jù)。測(cè)定各目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平是以Rps18(Ribosomal protein S18)作為內(nèi)參基因，各組實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)基因的mRNA水平表示為對(duì)照組表達(dá)量的數(shù)倍。所用引物的序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計(jì)結(jié)果用SPSS 13.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)均以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，顯著性水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠 為驗(yàn)證Sirt6ad-/-小鼠脂肪組織特異性Sirt6基因敲除成功，分別分離Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(f)的肝臟(Liver)、心臟(Heart)、腎臟(Kid)、棕色脂肪組織(BAT)、肌肉(SKM)、大腦(Brain)、脾臟(Spl)和白色脂肪組織(WAT)進(jìn)行Western Blotting檢測(cè)，如圖1所示，與野生型小鼠相比，Sirt6ad-/-小鼠只有棕色脂肪組織和白色脂肪組織不表達(dá)Sirt6，其余組織器官均表達(dá)Sirt6，說明實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建脂肪組織特異性Sirt6基因敲除小鼠模型-Sirt6ad-/-小鼠。

圖1 Western Blotting檢測(cè)Sirt6ad-/-小鼠和野生型小鼠不同組織中Sirt6蛋白的表達(dá)水平

2.2Sirt6ad-/-小鼠發(fā)生脂肪肝并伴有炎癥反應(yīng) 脂肪肝會(huì)使肝組織形態(tài)學(xué)發(fā)生顯著變化，為此我們剖檢正常飲食Sirt6ad-/-小鼠和野生型小鼠并分離出完整的肝臟組織進(jìn)行觀察(中插彩版圖2a)，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮紅的肝臟相比，Sirt6ad-/-小鼠的肝臟組織松散腫大、泛黃、表面可見散在顆粒狀突起。原位解剖高脂飲食的兩種基因型小鼠，同樣發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠肝臟相比，Sirt6ad-/-小鼠的肝臟組織仍是松散腫大、表面可見散在顆粒狀突起(中插彩版圖2b)。取正常飲食兩種基因型小鼠的肝臟組織制作組織切片，進(jìn)行H·E·染色，我們?cè)赟irt6ad-/-小鼠的肝臟組織切片中觀察到肝細(xì)胞重度脂肪變性，脂肪空泡成片出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的脂滴多為大泡型，有一些肝細(xì)胞的細(xì)胞核受脂肪空泡擠壓移至肝細(xì)胞邊緣，符合NAFLD表現(xiàn)(中插彩版圖2c)。正常肝細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的能力很小，超負(fù)荷的脂類沉積會(huì)影響代謝平衡，引起巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。對(duì)正常飲食和高脂飲食的兩種基因型小鼠肝臟進(jìn)行免疫組化染色試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠的肝臟均對(duì)抗CD68的抗體產(chǎn)生明顯陽性反應(yīng)，表明Sirt6ad-/-小鼠的肝臟發(fā)生巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)(中插彩版圖2d)。

2.3 脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠肝臟中參與脂肪生成關(guān)鍵基因的表達(dá)增多 脂肪生成主要是指非脂肪底物合成脂肪的過程，即從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成脂肪的過程，脂肪酸合成酶(Fas)和乙酰輔酶A羧化酶(Acc)是脂肪生成的關(guān)鍵酶，脂肪生成是造成肝臟脂肪沉積的重要原因[11]。此外，肝臟還可以通過Cd36攝入游離脂肪酸，增加肝臟中甘油三酯(TG)的含量[12]。利用實(shí)時(shí)定量PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠肝臟中Cd36以及參與脂肪生成關(guān)鍵基因的表達(dá)均有不同程度的升高(圖3a，b)。

圖3 脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠肝臟中參與脂肪生成關(guān)鍵基因的表達(dá)升高

a:Real-time PCR分析正常飲食時(shí)Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(floxed)肝臟中Cd36和參與脂肪生成的關(guān)鍵基因的表達(dá)情況;b:Real-time PCR分析高脂飲食時(shí)兩種基因型小鼠肝臟中Cd36和參與脂肪生成的關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。*P<0.05

2.4Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥因子的表達(dá)上調(diào) 過多的脂質(zhì)沉積會(huì)造成肝細(xì)胞中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其他細(xì)胞器的功能異常，并引發(fā)炎癥反應(yīng)。利用實(shí)時(shí)定量PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，兩種飲食情況下Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥標(biāo)記物的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)(圖4a，b)。

圖4Sirt6ad-/-小鼠肝臟中炎癥因子的表達(dá)上調(diào)

a:Real-time PCR分析正常飲食時(shí)Sirt6ad-/-小鼠(KO)和野生型小鼠(floxed)肝臟中炎癥標(biāo)記物的表達(dá);b:Real-time PCR分析高脂飲食時(shí)兩種基因型小鼠肝臟中炎癥標(biāo)記物的表達(dá)。*P<0.05

3 討論

Sirt6ad-/-小鼠會(huì)發(fā)生漸進(jìn)性肥胖，肥胖伴隨有脂肪細(xì)胞體積的變大，當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)輸送的養(yǎng)分不能夠滿足體積增大的脂肪細(xì)胞所需時(shí)，脂肪細(xì)胞會(huì)呈缺氧狀態(tài)并使HIF-1α被激活，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞死亡[13]。死亡的脂肪細(xì)胞會(huì)將原本儲(chǔ)存于脂滴中的脂類釋放到周圍組織中，游離的脂類會(huì)促使巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到脂肪組織中將游離脂類消滅，當(dāng)巨噬細(xì)胞缺乏將游離脂類全部吞噬的能力時(shí)，游離的脂類會(huì)隨循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入到肝臟等不宜儲(chǔ)存脂類的組織器官中[14-15]。過多的脂肪沉積會(huì)對(duì)肝臟造成脂質(zhì)毒性，使肝細(xì)胞中的細(xì)胞器功能異常，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)[16]。本試驗(yàn)中，脂肪組織特異性Sirt6基因敲除不僅使小鼠的肝臟發(fā)生脂肪沉積和炎癥反應(yīng)，還使小鼠肝臟中負(fù)責(zé)攝入游離脂肪酸和參與脂肪生成的關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)。

雖然肥胖極有可能是導(dǎo)致Sirt6ad-/-小鼠發(fā)生非酒精性脂肪肝的重要原因。但不能忽略的是，脂肪組織具有內(nèi)分泌功能，它能夠分泌多種脂肪因子調(diào)節(jié)糖脂代謝，如:瘦素、脂聯(lián)素、降脂素等[17-19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織尤其是棕色脂肪組織可以通過分泌Nrg4抑制肝臟的脂肪生成，從而抑制脂肪肝的產(chǎn)生[20]。本試驗(yàn)還不能排除脂肪組織特異性Sirt6基因敲除影響脂肪因子分泌的可能性，因此，要明確脂肪組織特異性Sirt6基因敲除使小鼠發(fā)生脂肪肝的機(jī)制以及脂肪組織Sirt6對(duì)機(jī)體糖脂代謝的調(diào)控作用還需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。