四川省重點包蟲病流行區(qū)土壤水等環(huán)境中蟲卵污染情況監(jiān)測

袁東波，郭 莉，侯 巍，莫 茜，尹 杰，周明忠，郝力力，陽愛國

(四川省動物疫病預防控制中心，四川成都610041)

細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲引發(fā)的棘球蚴病，統(tǒng)稱包蟲病，是一種嚴重的人獸共患寄生蟲病，主要感染人、牛羊等家畜以及小型嚙齒類動物。包蟲病不僅嚴重危害居民健康，而且導致包蟲病患者因病返貧，嚴重制約了當?shù)厣鐣?jīng)濟的發(fā)展。四川[1-2]、青海、寧夏、甘肅[3]以及新疆等省是包蟲病高發(fā)地區(qū)，其中四川省的甘孜州和阿壩州全州、雅安市的天全縣和寶興縣以及涼山州的木里縣和越西縣均是包蟲病流行區(qū)域。

人和動物感染包蟲病主要是經(jīng)口感染(比如誤食被包蟲蟲卵污染的水和食物，手接觸了被蟲卵污染的土壤或者犬的皮毛)，蟲卵經(jīng)口進入胃，在宿主消化液作用下發(fā)育成六鉤蚴經(jīng)腸壁進入血液。中絳期的幼蟲可在患者及動物體內像腫瘤樣生長發(fā)育和侵潤遷移，對肝臟等臟器損害嚴重。包蟲的蟲卵已在孕節(jié)內提前發(fā)育為六鉤蚴，不需要在外界環(huán)境中發(fā)育，因此隨糞便排出的蟲卵已經(jīng)完全發(fā)育成熟，對人和其他中間宿主均已具有感染力。除此之外，蟲卵對低溫抵抗力極強，能在外界環(huán)境中長期存活并保持感染力。細粒棘球絳蟲蟲卵-80 ℃至少需要7 d方能徹底滅活，而在7 ℃可存活200 d以上，21 ℃可存活50天[4-5]。多房棘球絳蟲蟲卵在實驗室4 ℃水中可存活16個月[4-5]。在德國南部，秋冬季節(jié)可存活8個月，夏季可存活78 d，在潮濕土壤中也可存活很長時間[6]。

本試驗的目的是對本省包蟲病流行地區(qū)自然環(huán)境中包蟲蟲卵污染情況進行初步調查，為進一步完善包蟲病防控措施提供數(shù)據(jù)及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 共采集新鮮犬糞850份，其中：石渠縣103份、爐霍縣97份、甘孜縣90份、天全縣281份、寶興縣279份；土壤樣本61份，取地表土層1 cm內的土壤，每份100 g左右，其中：石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)21份，爐霍縣10份、色達縣10份，所有土壤樣本均采集于犬舍為中心100平米范圍內；犬頸部毛發(fā)樣本39份，其中石渠縣A鄉(xiāng)20份、石渠縣B鄉(xiāng)19份；公路旁地表水樣本80份，其中石渠縣A鄉(xiāng)30份、石渠縣B鄉(xiāng)10份、石渠縣C鄉(xiāng)20份以及爐霍縣20份，每份50 mL左右。由于犬糞是環(huán)境中蟲卵的唯一來源，所以采集犬糞、犬舍周圍土壤及犬毛過程中，必須做好安全防護，避免感染包蟲蟲卵。

1.2 主要試劑及儀器 Power SYBR Green PCR Master Mix，購自ABI公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；糞便及土壤樣本徹底破碎采用Bertin Precellys 24組織破碎儀；樣本總DNA提取采用E.Z.N.A Stool DNA Kit；最終檢測儀器為杭州博日9600型熒光PCR儀。

1.3 核酸的提取 所有樣本的核酸提取均采用E.Z.N.A Stool DNA Kit試劑盒，按照說明書進行操作。其中，土壤及犬糞樣本需用Bertin Precellys 24組織破碎儀充分破碎后再進行核酸提??；水體樣本需至少13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，再進行核酸提??；犬毛需在50 mL試管中，用超純水充分震蕩洗滌后，13 000 r/min離心5 min后收集沉淀，提取核酸。所有樣本最后洗脫的總DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測方法 通過生物信息學對細粒棘球絳蟲G1，G6和G7株及多房棘球絳蟲大量序列進行比對分析，選取線粒體上ND1基因作為檢測基因，產(chǎn)物長度為98 bp，所用引物序列及反應體系均采用先前本實驗室建立的方法[7]。PCR體系為50 μL，上下游引物終濃度分別為0.3 μmol/L，模板1-3 μL(約為5 ng)。反應條件為預變性：94 ℃5 min；變性94 ℃30s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)，按照儀器默認設置添加熔解曲線分析步驟。其中陽性對照細粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲陽性DNA均由本實驗保存。

2 結果

2.1 檢測結果 所有樣本檢測結果如表1所示，犬糞樣本：石渠縣、爐霍縣、甘孜縣、天全縣和寶興縣包蟲陽性率分別為 3.9%、38.1%、27. 8%、100%、6.1%和8.2%，總陽性率為12.4%；土壤樣本：石渠縣A鄉(xiāng)、石渠縣B鄉(xiāng)、爐霍縣和色達縣陽性率分別為 15.0%、14.3%、20.0%和0，總陽性率為13.1%；犬毛樣本：石渠縣A鄉(xiāng)和石渠縣B鄉(xiāng)陽性率分別為10.0%和5.3%，總陽性率為7.7%；所有水體樣本均為陰性。

表1 環(huán)境中所采集的樣本信息及檢測結果

2.2 PCR產(chǎn)物的特異性 通過熔解曲線分析，所有陽性樣本的熔解峰均與陽性對照吻合，且均為單峰，說明整個PCR反應特異性好，產(chǎn)物均為目的基因產(chǎn)物，無非特異性產(chǎn)物。

3 討論

四川省甘孜州和阿壩州全州、雅安市的寶興縣和天全縣、涼山州的木里縣和越西縣是包蟲病流行區(qū)域，其中甘孜州、阿壩州的部分地區(qū)屬于重度流行區(qū)。尤其是甘孜州的石渠縣，是全世界包蟲病研究中心，同時也是最嚴重的地區(qū)，而寶興縣、天全縣、木里縣和越西縣均屬于輕度流行區(qū)。

犬糞便中的蟲卵是感染人和動物的唯一階段，感染途徑主要是犬糞污染環(huán)境，包括土壤、水源以及犬體表的被毛等，人和動物通過直接接觸犬糞以及上述被犬糞污染的環(huán)境，經(jīng)口攝入蟲卵導致感染。由于包蟲蟲卵已在體內發(fā)育成熟，排出犬體外就已經(jīng)具有感染性，而且對低溫具有很強抵抗力，所以一旦犬糞污染周圍環(huán)境，很容易造成人和動物感染包蟲。造成犬糞污染環(huán)境主要有以下因素：(1)當?shù)鼐用駥Πx病認識及重視程度低，犬只不經(jīng)常拴養(yǎng)，導致犬糞污染居住地周邊環(huán)境；(2)夏季牧場時期，犬只需保護家畜免遭狼、狐貍捕食，必須自由活動，無法拴養(yǎng)；(3)當?shù)鼐用駥θS無法進行有效處理: 高原地區(qū)地廣人稀，居住分散，很難做到犬糞的統(tǒng)一回收、消毒和處理，因此犬糞長時間暴露于外界環(huán)境中。據(jù)報道，在波蘭，從當?shù)胤N植的蔬菜表面、野生蘑菇及土壤中均檢測出了多房棘球絳蟲蟲卵DNA[8-10]。犬糞中的蟲卵粘附于犬被毛，也是造成人感染的一個重要途徑。川西北地區(qū)的甘孜州和阿壩州大部分地區(qū)犬只數(shù)量眾多，以甘孜州石渠縣為例，目前登記在冊的犬只大約2萬只左右，家家養(yǎng)犬，人與犬接觸頻繁，尤其是兒童，在與犬接觸玩耍后未能馬上洗手，很容易將犬體表被毛上的蟲卵攝入口中，造成感染。2017年9月本人在石渠縣德榮瑪鄉(xiāng)調查時發(fā)現(xiàn)，就有6～12歲兒童感染包蟲的病例。另據(jù)報道，在哈薩克斯坦，1988-1995年期間，包蟲發(fā)病率在1.4人/10萬，但從1997-2000年增長到了3.5～8.3人/10萬，其中29%的患者是年齡14歲以下的兒童[11]。犬糞也可能污染地表水源，但在本研究中所有水體樣本均未檢出包蟲蟲卵，原因可能是水源中即使被污染蟲卵，數(shù)量也很少，加之每份樣本量只有50 mL，很難富集到蟲卵。因此，對地表水源中蟲卵的檢測可能需要設計專門的過濾裝置，前期對大量水體進行過濾，富集蟲卵，才有可能檢出。本試驗中采用的熒光PCR方法，特異性強，靈敏度高，能夠同時檢出細粒和多房棘球絳蟲，尤其適合復雜樣本(犬糞、土壤)中目的基因的檢測，而且對ELISA陰性/陽性樣本復核率高，不存在漏檢和假陽性，非常適合后期環(huán)境中蟲卵的持續(xù)監(jiān)測。

寄生蟲蟲卵普遍具有堅固的外殼，除對外界不良環(huán)境有較強的適應性外，還對常規(guī)的消毒劑具有很強的抵抗力，如柔嫩艾美耳球蟲的卵囊在次氯酸鈉溶液中浸泡0.5 h，對其活力及感染性無明顯影響。由于包蟲蟲卵污染的均為自然環(huán)境，如土壤、草地、犬的被毛等，存在大量易與消毒劑發(fā)生反應的有機物，導致消毒效果大大降低，無法達到殺滅蟲卵的效果。因此，后期迫切需要篩選合適的消毒劑，用于高原地區(qū)環(huán)境中蟲卵的殺滅，以確保人和家畜的安全，提高當?shù)毓残l(wèi)生水平。

綜上所述，本研究在犬糞、土壤及犬毛樣本中均檢出了包蟲蟲卵DNA，說明當?shù)鼐用癫糠殖潭壬洗嬖趶沫h(huán)境中感染包蟲的風險。我國從2015年開始，投入大筆專項資金，全面開展包蟲病防控工作，包括犬只管理與驅蟲、牛羊免疫、草原鼠害治理以及包蟲病宣傳教育等措施，取得了顯著效果。在此基礎上，如能進一步開展環(huán)境中包蟲蟲卵的持續(xù)監(jiān)測，將為進一步降低人和動物感染包蟲風險，以及完善包蟲病防控體系提供數(shù)據(jù)支撐和技術支持。