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    實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)輔助診斷肺外結(jié)核的臨床價(jià)值

    2018-10-15 05:24:02聶曉平李桓楊洪英羅明楊國(guó)強(qiáng)周刊黃正谷王鵬森廖傳玉張匯征周剛陳玉陳耀凱石濤李同心
    中國(guó)防癆雜志 2018年10期
    關(guān)鍵詞:敏感度結(jié)核例數(shù)

    聶曉平 李桓 楊洪英 羅明 楊國(guó)強(qiáng) 周刊 黃正谷 王鵬森 廖傳玉 張匯征 周剛 陳玉 陳耀凱 石濤 李同心

    結(jié)核病是一種長(zhǎng)期危害人類身體健康的慢性傳染病,其臨床表現(xiàn)多樣,其中80%發(fā)生在肺部,其他部位(頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼等)也可繼發(fā)感染[1]。WHO[2]在《2015年全球結(jié)核病報(bào)告》中指出,我國(guó)2014年臨床確診近53萬(wàn)例新發(fā)患者中有3.2萬(wàn)例肺外結(jié)核患者。肺外結(jié)核由于病變部位廣泛、臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,早期診斷和鑒別診斷較為困難。

    快速、敏感的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)是輔助臨床提高肺外結(jié)核早期診斷的重要手段。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simultaneous amplification and testing,SAT)是近年來(lái)我國(guó)結(jié)核實(shí)驗(yàn)室使用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法之一,主要用于檢測(cè)痰液里的結(jié)核分枝桿菌(MTB)來(lái)輔助診斷肺結(jié)核患者[3-9]。為了明確SAT用于重慶區(qū)域肺外結(jié)核輔助診斷的臨床價(jià)值和意義,本研究對(duì)該類患者樣本采用SAT、羅氏培養(yǎng)和液體培養(yǎng)(以下兩種培養(yǎng)方法簡(jiǎn)稱“培養(yǎng)法”)同步檢測(cè)并比較結(jié)果,評(píng)估其敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值等指標(biāo)。

    資料和方法

    一、研究對(duì)象、試驗(yàn)儀器及試劑

    1.標(biāo)本來(lái)源:連續(xù)收集重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心結(jié)核科、普通外科與骨科2016年1月至2017年12月期間收治482例患者的送檢標(biāo)本(主要為病變部位的膿液或手術(shù)取出物);含433例肺外結(jié)核(作為試驗(yàn)組)和49例排除結(jié)核病的其他疾病(作為對(duì)照組),全部患者均由結(jié)核??漆t(yī)生臨床確診,診斷肺外結(jié)核和排除結(jié)核病參照文獻(xiàn)[10-14],診斷不明確的不納入本研究。其中,男259例,女223例,年齡范圍7~79歲,平均年齡(35.5±17.1)歲, 12例患者臨床血液檢測(cè)HIV抗體為陽(yáng)性。對(duì)照組49例患者中有10例頸部淋巴結(jié)炎,6例胸膜炎,6例膝關(guān)節(jié)炎,6例腰椎融合術(shù)后,5例膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后,4例液氣胸,3例腹股溝膿腫,3例腋窩淋巴結(jié)炎,2例肛周膿腫,2例踝關(guān)節(jié)炎,2例心包積液,1例睪丸鞘膜積液。本研究均取得患者知情同意和重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)同意。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)參考菌株(H37Rv)來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。

    2.主要儀器及試劑來(lái)源:本研究使用的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、雜菌抑制劑(PAN-TA)、分枝桿菌培養(yǎng)管(MGIT)及營(yíng)養(yǎng)添加劑(OADC)均來(lái)源于美國(guó)BD公司。BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來(lái)源于美國(guó)伯樂(lè)公司。中性改良羅氏培養(yǎng)基購(gòu)于珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司。結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(RNA恒溫?cái)U(kuò)增法,商品名為“TB-SAT”)購(gòu)于上海仁度生物科技有限公司。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸提取、檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)和Lab-Aid 824型自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)于廈門(mén)致善生物科技股份有限公司。分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。

    二、方法

    1.標(biāo)本采集:患者病變部位的膿液或手術(shù)過(guò)程中取出物由臨床醫(yī)生留取,低溫保存,及時(shí)送檢。

    2.標(biāo)本前處理:標(biāo)本前處理按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[15]堿處理-中和離心沉淀法的要求進(jìn)行,離心后的沉淀物用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸,均等分為3份,留1份于-20 ℃?zhèn)溆茫?份分別用于結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)和TB-SAT檢測(cè)。

    3.標(biāo)本分離培養(yǎng):取1份重懸液,按照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[15]和BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)將PBS重懸后的沉淀物同步接種于MGIT和中性羅氏培養(yǎng)基。結(jié)果記錄參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[15]。本研究中以上2種培養(yǎng)方法任意一種結(jié)果為陽(yáng)性,即視為樣本培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。

    4.標(biāo)本TB-SAT檢測(cè):取一份重懸液按照TB-SAT 試劑說(shuō)明書(shū)操作,具體步驟:離心半徑8.8 cm,13 000 r離心 5 min ,棄上清,再用1 ml無(wú)菌生理鹽水洗滌1次后加入50 μl TB裂解液重懸,超聲(功率300 W)處理15 min。取樣前,離心半徑8.8 cm,10 000 r 離心 2 min。取2 μl離心后樣本上清液加入含30 μl擴(kuò)增檢測(cè)液的微量反應(yīng)管中,將微量反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min,再置于42 ℃保溫5 min,同時(shí)將反應(yīng)酶預(yù)熱至42 ℃,最后向每支反應(yīng)管中加入10 μl反應(yīng)酶,迅速混勻并轉(zhuǎn)至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。反應(yīng)程序:熒光通道設(shè)定為羧基熒光素(FAM),每個(gè)循環(huán)為42 ℃、1 min,共40個(gè)循環(huán);熒光信號(hào)收集1次/min,共檢測(cè)40次。閾值設(shè)定:以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性判斷值(dt)≤35的樣本為陽(yáng)性;dt為35~40的樣本建議重新檢測(cè),重測(cè)結(jié)果dt<40為陽(yáng)性;dt無(wú)數(shù)值或?yàn)?0的樣本為陰性。質(zhì)量控制:每次檢測(cè)都必須做陰性和陽(yáng)性對(duì)照,且陽(yáng)性對(duì)照dt≤35,陰性對(duì)照無(wú)數(shù)值或?yàn)?0,否則需重復(fù)試驗(yàn)。

    5.MTB鑒定:對(duì)培養(yǎng)法和TB-SAT結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行MTB鑒定。取備用的重懸液按照廈門(mén)致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸提取、檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光PCR法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定。

    6.分枝桿菌菌種鑒定:對(duì)培養(yǎng)法陽(yáng)性、TB-SAT結(jié)果陰性的樣本,進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。按照亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的分枝桿菌菌種鑒定基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),采用反向點(diǎn)雜交法進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system,HIS;為上海瑞美電腦科技有限公司產(chǎn)品)檢索統(tǒng)計(jì)患者病歷信息,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別與培養(yǎng)法、患者臨床診斷比較,計(jì)算SAT檢測(cè)方法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。培養(yǎng)法和SAT檢測(cè)MTB的陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、TB-SAT與培養(yǎng)法MTB檢測(cè)結(jié)果比較

    本研究共納入433例肺外結(jié)核患者的標(biāo)本:127例培養(yǎng)法陽(yáng)性的標(biāo)本中TB-SAT檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者有107例,陰性結(jié)果有20例;306例培養(yǎng)法陰性的患者中TB-SAT檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性者有73例,陰性結(jié)果有233例。49例對(duì)照組樣本中有1例標(biāo)本為培養(yǎng)法陽(yáng)性、TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陰性,其余48例標(biāo)本培養(yǎng)法與TB-SAT檢測(cè)結(jié)果均為陰性。試驗(yàn)組培養(yǎng)法的陽(yáng)性檢出率為29.3%(127/433),TB-SAT 陽(yáng)性檢出率為41.8%(181/433);對(duì)照組培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率為2.0%(1/49),TB-SAT陽(yáng)性檢出率為0.0%(0/49)。試驗(yàn)組TB-SAT與培養(yǎng)法兩者的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=30.20 ,P<0.05),對(duì)照組TB-SAT與培養(yǎng)法兩者的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00 ,P>0.05),見(jiàn)表1。

    以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),則TB-SAT檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354)、59.4%(107/180)、93.0%(281/302)、83.6%(107/128)。以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn),則培養(yǎng)法的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49)、99.2%(127/128)、13.6%(48/354)、36.3%(175/482);TB-SAT檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和符合率分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)、100.0%(180/180)、16.2%(49/302)、47.5%(229/482),詳見(jiàn)表2。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率培養(yǎng)法為29.3%(127/433),SAT法為41.6%(180/433)(χ2=14.17,P<0.05)。

    表1 兩組患者分別采用TB-SAT與培養(yǎng)法的檢測(cè)陽(yáng)性率比較

    表2 兩組患者TB-SAT與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果及以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

    注各項(xiàng)指標(biāo)定義:敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性人數(shù))×100%,特異度度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%,符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性人數(shù))/總例數(shù)×100%

    二、TB-SAT與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本MTB鑒定結(jié)果

    482例樣本中TB-SAT與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本有94例,其中TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性、培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陰性的樣本有73例(均來(lái)自試驗(yàn)組);TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的樣本有21例(僅1例來(lái)自對(duì)照組)。對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行MTB鑒定,結(jié)果顯示:試驗(yàn)組73例TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陰性的樣本中MTB鑒定結(jié)果陽(yáng)性有70例,陰性有3例;試驗(yàn)組20例TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的樣本中MTB鑒定結(jié)果陽(yáng)性有3例,陰性有17例。1例對(duì)照組TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的樣本MTB鑒定結(jié)果為陰性。

    三、分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果

    TB-SAT結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽(yáng)性的菌株有21株(例),分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果顯示:3株(例)為胞內(nèi)分枝桿菌,1株(例)為龜分枝桿菌膿腫亞種,1株(例)為戈登分枝桿菌,其余16株(例)為MTB(含試驗(yàn)組3例TB-SAT檢測(cè)結(jié)果陰性、培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性且MTB鑒定結(jié)果陽(yáng)性的樣本)。

    討 論

    SAT是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)原理:同一溫度下,首先通過(guò)莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus) 逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)產(chǎn)生靶標(biāo)核酸(RNA)的一個(gè)雙鏈DNA拷貝,然后利用T7 RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)(100~1000個(gè))RNA拷貝;每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開(kāi)始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán);同時(shí),帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合,產(chǎn)生熒光,該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲,實(shí)時(shí)反映擴(kuò)增循環(huán)情況。近年來(lái)該技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)痰液中的MTB,以早期診斷肺結(jié)核,但用于檢測(cè)肺外結(jié)核的臨床價(jià)值報(bào)道少見(jiàn)。

    本研究同步采用羅氏培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法和SAT三種方法檢測(cè)肺外結(jié)核標(biāo)本MTB,共納入482例患者,研究結(jié)果較客觀、準(zhǔn)確。以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),則TB-SAT檢測(cè)的敏感度、特異度分別為83.6%(107/128)、79.4%(281/354),兩種方法符合率為83.6%(107/128)。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),則培養(yǎng)法的敏感度、特異度分別為29.3%(127/433)、98.0%(48/49);TB-SAT檢測(cè)的敏感度、特異度分別為41.6%(180/433)、100.0%(49/49)。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道,SAT應(yīng)用于檢測(cè)痰液中MTB的敏感度在37.6%~56.5%之間[16-19];方法相同,卻有一定的差異。Fan等[20]研究者認(rèn)為,差異與痰標(biāo)本的處理、運(yùn)輸和局灶性肺結(jié)核等原因有關(guān),與方法本身關(guān)系不大。以臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn),本研究SAT檢測(cè)的特異度為100.0%(49/49),高于培養(yǎng)法的特異度[98.0%(48/49)],主要由于SAT檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果可以排除NTM的單一感染或確定MTB感染;SAT和培養(yǎng)法均不能區(qū)分同一患者M(jìn)TB和NTM的混合感染。SAT一般可在2 h內(nèi)完成,培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng),當(dāng)SAT和痰涂片結(jié)果均為陽(yáng)性,不需要等待培養(yǎng)結(jié)果即可及時(shí)明確患者是否感染MTB。本研究SAT陰性預(yù)測(cè)值較低,提示臨床醫(yī)生不能依據(jù)該檢測(cè)結(jié)果排除結(jié)核病,臨床上仍需要借助其他檢查結(jié)果以明確診斷。

    羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)分枝桿菌是傳統(tǒng)且經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室方法,長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn),通常其檢測(cè)結(jié)果也作為評(píng)估新MTB檢測(cè)試劑的金標(biāo)準(zhǔn)。考慮分枝桿菌自身活力、L型,以及羅氏培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件等因素影響,本研究采用羅氏培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本,以期提高培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的敏感度。實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)MTB核酸試劑有著較高的敏感度和特異度,當(dāng)SAT與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí),本研究采用另一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。也有大型隊(duì)列研究進(jìn)一步分析了SAT檢測(cè)方法的敏感度,當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí),進(jìn)行一次SAT重復(fù)檢測(cè),其檢測(cè)敏感度可達(dá)75.8%[21]。本研究對(duì)94例TB-SAT與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行MTB鑒定,TB-SAT與實(shí)時(shí)熒光PCR法一致率為92.6%(87/94)。為了進(jìn)一步證實(shí)前述各方法的一致性,本研究對(duì)21例TB-SAT 結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽(yáng)性的菌株進(jìn)行了分枝桿菌菌種鑒定,結(jié)果顯示僅有5例為NTM,另16例為MTB,占76.2%(16/21),即臨床上不能忽視SAT陰性而培養(yǎng)陽(yáng)性的患者感染MTB的可能性。3例TB-SAT結(jié)果陰性、培養(yǎng)法陽(yáng)性而MTB鑒定為陽(yáng)性,分析原因可能標(biāo)本中含有影響TB-SAT 擴(kuò)增反應(yīng)的雜質(zhì),或者非痰液樣本(如膿液、組織等)的特殊成分構(gòu)成導(dǎo)致樣本中MTB分布不均,或樣本中MTB菌量較少、裂解液中模板分布不均勻等。73例培養(yǎng)法陰性、TB-SAT陽(yáng)性的樣本經(jīng)PCR法鑒定,結(jié)果顯示70例TB-SAT與PCR法均為陽(yáng)性,占95.9%(70/73);另3例培養(yǎng)陰性、TB-SAT 陽(yáng)性、PCR法為陰性的樣本沒(méi)有進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí),這也是研究的不足之處。

    SAT除了具有反應(yīng)穩(wěn)定、敏感度與特異度較高等優(yōu)點(diǎn)外,該技術(shù)實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)條件簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,不需要溫度循環(huán),其擴(kuò)增效率高,反應(yīng)時(shí)間短;RNA擴(kuò)增產(chǎn)物和模板均為RNA,RNA容易降解,可大大減少實(shí)驗(yàn)室污染。

    綜上所述,TB-SAT檢測(cè)是一項(xiàng)簡(jiǎn)便快速、敏感度和特異度較培養(yǎng)法高的結(jié)核病檢測(cè)方法,臨床上可應(yīng)用于輔助診斷肺外結(jié)核,同時(shí)可在一定程度上提高培養(yǎng)陰性肺外結(jié)核患者的陽(yáng)性檢出率。

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