單永梅 王偉炳 王建美
耐多藥結核病已成為當前我國結核病防治工作面臨的主要挑戰(zhàn)之一[1]。結核分枝桿菌生長緩慢,目前實驗室檢測的傳統(tǒng)方法是先培養(yǎng)后再進行比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”),在檢測順利的情況下,至少耗時2~3個月。傳統(tǒng)培養(yǎng)加藥敏試驗檢測雖結果可靠,但費時且不利于患者的早期治療,可能促使耐藥菌株的增多和播散。研究顯示,應用DNA微陣列芯片法可快速、準確地檢測結核分枝桿菌及其耐藥性[2-6]。筆者以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗檢測結果為標準,評估DNA微陣列芯片法對涂陽患者痰標本中結核分枝桿菌的檢出情況,及其對異煙肼和利福平耐藥性檢測的效果,從而評估DNA微陣列芯片法的應用價值。
收集2011年1月至2017年5月間在江蘇省灌云縣疾病預防控制中心登記的814例涂陽肺結核患者的痰標本。凡符合下列三項之一者為涂陽肺結核患者:(1)2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性;(2)1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性,肺部影像學檢查符合活動性肺結核表現;(3)1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性,1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性[7]。涂陽肺結核患者中,男627例(77.03%),女187例(22.07%);年齡范圍16~98歲,中位年齡53(30,66)歲。將新發(fā)患者與2、3個月末痰涂片陽性者歸為初治患者;將復發(fā)、返回、初治失敗、復治失敗、其他歸類為復治患者[8];初治涂陽患者599例(73.59%),復治涂陽患者215例(26.41%)。
由縣級結核病定點醫(yī)院的實驗室醫(yī)生對痰標本進行粗篩,留下合格的標本(干酪樣、褐色血痰、含有少量新鮮血液的血痰、黏液痰等)進行痰涂片檢查,采用直接痰液涂片鏡檢法檢測。痰標本的收集、涂片、鏡檢報告、質量控制及涂片保存等均嚴格按照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[9]。對于不合格的標本,退回并進一步指導患者重新留痰送檢。涂陽標本統(tǒng)一送市級結核病定點醫(yī)院做快速診斷、傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗。培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術有限公司,所有操作與結果判讀嚴格按照標準操作規(guī)程和儀器或設備說明書進行。
1. 菌懸液制備和稀釋:用接種環(huán)取2~5 mg培養(yǎng)基上的菌落,研磨后與標準麥氏管比對,配制成1 mg/ml 的菌懸液,梯度稀釋為10-1、10-2和10-4mg/ml。
2. 羅氏培養(yǎng):吸取0.1 ml濃度為10-1mg/ml的菌懸液,分別接種到對照羅氏培養(yǎng)管及對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)兩種藥敏羅氏培養(yǎng)基表面,盡量使菌液均勻鋪滿斜面。接種后的培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結果。判斷標準:(1)若PNB(-)和TCH(+),初步鑒定為結核分枝桿菌;(2)若PNB(-)和TCH(-),初步鑒定為牛分枝桿菌;(3)若PNB(+)和TCH(+),初步鑒定為非結核分枝桿菌菌群。羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術有限公司,規(guī)格為7 ml/支。
3. 比例法藥敏試驗:用標準接種環(huán)分別沾取1滿環(huán)(即0.01 ml)10-2和10-4mg/ml的菌懸液,用劃線法均勻接種至對照培養(yǎng)管培養(yǎng)基表面和藥敏培養(yǎng)管培養(yǎng)基表面,盡量使菌液均勻鋪滿斜面。接種后的培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結果。耐藥百分比(%)=(含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數)/(對照培養(yǎng)基上生長的菌落數)×100%。耐藥百分比≥1%,報告耐藥(R);耐藥百分比<1%,報告敏感(S)。若10-4mg/ml濃度的菌懸液在對照培養(yǎng)基上生長的菌落數少于20個菌落,則應從對照管傳代培養(yǎng),重復試驗。藥敏試驗培養(yǎng)基購自珠海貝索生物技術有限公司,規(guī)格為7 ml/支。
4. 分離培養(yǎng)和藥敏熟練度測試:分離培養(yǎng)涂陽培陰率小于10%,污染率小于5%;比例法藥敏試驗操作人員須通過國家藥敏熟練度考核測試。
1.檢測原理:以臨床樣品中分離的結核分枝桿菌DNA為模板,運用不對稱PCR技術進行擴增反應,由于引物末端標記有熒光分子,在擴增過程中待檢測的DNA分子將被擴增為帶有熒光分子的DNA片段。將標記有熒光分子的PCR擴增產物與芯片上的探針在一定條件下進行雜交反應,根據堿基互補配對原則,序列匹配的PCR擴增產物與探針形成穩(wěn)定的二級結構。根據探針在芯片上的特定位置排布,可判讀相應被測細菌信息,從而鑒定出該細菌的種類與判斷耐藥情況。晶芯?分枝桿菌菌種鑒定系統(tǒng)和晶芯?結核分枝桿菌耐藥基因檢測系統(tǒng)均購自北京博奧生物有限公司。
2. 操作步驟:(1)痰標本處理。取患者痰液標本2~3 ml,加入1~2倍體積現配4% NaOH溶液,振蕩混勻,室溫靜置15~20 min,吸取1 ml上清液于微量離心管中,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min 離心5 min,棄去上清液,再加入1 ml生理鹽水,充分振蕩后,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min離心5 min,棄去上清液。(2)核酸DNA提取。向離心管加入80 ml 核酸提取液,振蕩混勻后轉入核酸提取管中,加入上一步經處理后的痰液標本,用晶芯Extractor TM36核酸快速提取儀振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min離心1 min。(3)PCR擴增:每份樣品進行3管PCR擴增反應。將PCR擴增試劑1、2、3各18 ml分別放入3管,將核酸提取物2 ml依次加入到3個管中,每管PCR反應體系總體積為20 ml。擴增條件:37 ℃ 600 s,1個循環(huán);94 ℃ 600 s,1個循環(huán);94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,35個循環(huán);94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,10個循環(huán);72 ℃ 420 s,1個循環(huán);分別得到PCR產物1、2、3。(4)芯片雜交:將PCR產物1、2、3置于PCR儀中95 ℃變性5 min,隨后立即置于冰水混合物中5 min;按照9 ml雜交緩沖液、3 ml PCR產物1和 3 ml PCR產物2配制雜交混合物R;9 ml雜交緩沖液、3 ml PCR產物1和3 ml PCR產物3配制雜交混合物H。吸取13.5 ml雜交混合物R和雜交混合物H分別經蓋片加樣孔加入利福平微陣列(微陣列1或3)和異煙肼微陣列(微陣列2或4)中,迅速蓋上雜交盒并密封,立即放入芯片雜交儀中50 ℃雜交2 h,轉速為5 r/min。(5)芯片清洗干燥及結果判讀:雜交反應結束后,將雜交盒水平取出拆開,將芯片取出,使用SideWasherTM8芯片洗干儀清洗芯片,使用晶芯?LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯?菌種鑒定檢測分析系統(tǒng)、晶芯?分枝桿菌藥敏檢測分析系統(tǒng)進行信號的讀取及結果判斷。
3. 質量控制:試驗前對實驗室操作人員進行技術培訓,對20份質量控制標本(結核分枝桿菌DNA標本)進行熟練度測試,符合率為100%。
應用EpiData 3.1軟件進行數據的錄入并進行一致性檢驗,SAS 9.2軟件對數據進行統(tǒng)計分析。利用傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗的檢測結果作為標準,評價DNA微陣列芯片法的檢測效能。各項指標的計算方法:敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%;特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%;陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%;陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。采用Kappa檢驗對檢測結果可靠性進行評價,Kappa值判定標準: 0.0~0.20為極低一致,0.21~0.40為一般一致,0.41~0.80為中高度一致,0.81~1.00為完全一致[10]。計數資料的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
DNA微陣列芯片法對涂陽肺結核患者的結核分枝桿菌檢出率為86.1%(701/814),高于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的82.4%(671/814),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.81,P<0.05)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測結果作為標準,DNA微陣列芯片法檢測涂陽患者結核分枝桿菌敏感度和特異度分別為92.4%和43.4%,Kappa=0.39,陽性預測值和陰性預測值分別為88.5%和54.9%,見表1。
DNA微陣列芯片法對初治涂陽肺結核患者結核分枝桿菌檢出率為88.5%(530/599),傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的檢出率為88.5%(530/599),差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.00,P=1.000)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測結果作為標準,DNA微陣列芯片法檢測初治涂陽患者結核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為93.4%和49.3%,Kappa=0.43,陽性預測值和陰性預測值分別為93.4%和49.3%,見表1。
DNA微陣列芯片法對復治涂陽肺結核患者的結核分枝桿菌檢出率為79.5%(171/215),高于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的65.6%(141/215),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.52,P<0.05)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測結果作為標準,DNA微陣列芯片法檢測復治涂陽患者結核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為88.7%和37.8%,Kappa=0.29,陽性預測值和陰性預測值分別為73.1%和63.6%,見表1。
814例進行傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)的涂陽肺結核患者中,671例檢測結果為“結核分枝桿菌”,43例檢測結果為“非結核分枝桿菌病”,76例(9.3%)為“培養(yǎng)陰性”,24例(2.9%)為“培養(yǎng)污染”,分離培養(yǎng)涂陽培陰率小于10%,污染率小于5%,符合質量控制要求。對814例涂陽肺結核患者的傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法與DNA微陣列芯片法結果進行比較,剔除無效結果包括傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法中鑒定為非結核分枝桿菌、培養(yǎng)陰性、培養(yǎng)污染與DNA微陣列芯片法中判定非結核分枝桿菌(9例)、結果無法判讀(87例)、未檢測到分枝桿菌(17例)等情況,共獲得620例患者的有效結果并對其進行分析,見圖1。620例患者中,男470例(75.8%),女150例(24.2%);初治涂陽患者495例(79.8%),復治涂陽患者125例(20.2%)。
表1 DNA微陣列芯片法對涂陽肺結核患者結核分枝桿菌的檢測效能(以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法為標準)
注陽性表示檢測結果為結核分枝桿菌;陰性表示檢測結果為其他(包括傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法中鑒定為非結核分枝桿菌、培養(yǎng)陰性、培養(yǎng)污染;DNA微陣列芯片法中判定為非結核分枝桿菌、結果無法判讀、未檢測到分枝桿菌等情況)
圖1 進行耐藥情況分析的有效患者納入流程圖
以比例法藥敏試驗檢測結果為標準,DNA微陣列芯片法檢測初治涂陽患者是否耐多藥的敏感度和特異度分別為90.5%和100.0%,Kappa=0.97,陽性預測值和陰性預測值分別為100.0%和99.6%;檢測復治涂陽患者是否耐多藥的敏感度和特異度分別為69.6%和98.0%,Kappa=0.74,陽性預測值和陰性預測值分別為88.9%和93.5%;檢測初治涂陽患者是否對異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.7%和96.4%,Kappa=0.71,陽性預測值和陰性預測值分別為69.8%和97.7%;檢測復治涂陽患者是否對異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為71.9%和95.7%,Kappa=0.71,陽性預測值和陰性預測值分別為85.2%和90.8%;檢測初治涂陽患者是否對利福平耐藥的敏感度和特異度分別為84.6%和98.3%,Kappa=0.77,陽性預測值和陰性預測值分別為73.3%和99.1%;檢測復治涂陽患者是否對利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89.3%和96.9%,Kappa=0.86,陽性預測值和陰性預測值分別為89.3%和96.9%,見表2。
實驗室構建檢測結核分枝桿菌方法的優(yōu)劣是控制耐藥疫情的關鍵。傳統(tǒng)的耐多藥肺結核診斷方法是對患者的痰標本進行細菌培養(yǎng)和藥敏試驗,一般需要2~3個月時間得到結果,不能解決耐多藥肺結核患者的早期診斷問題,在傳播的過程中加劇了耐藥結核病的發(fā)展。近10年來,結核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢[11-12],異煙肼和利福平作為抗結核一線藥物,其耐藥性檢測對于臨床結核病藥物治療具有重要意義[13]。新型的分子檢測技術是近年來開發(fā)用于檢測結核分枝桿菌耐藥基因的熱點技術[14],DNA微陣列芯片法作為一種高通量自動化檢測技術,能為臨床耐藥結核病的篩查與防治提供良好的技術支持[15]。
表2 DNA微陣列芯片法對涂陽肺結核患者耐藥情況的檢測效能(以比例法藥敏試驗為標準)
2013年,劉亞芹等[5]通過DNA微陣列芯片法和比例法同時對54株結核分枝桿菌進行異煙肼和利福平的耐藥性檢測,對結果進行比較分析后發(fā)現,DNA微陣列法對異煙肼和利福平的耐藥檢測結果與比例法的符合率分別為75.00%和91.00%,認為DNA微陣列芯片法適用于臨床一線對耐藥結核分枝桿菌的快速篩查。2014年,郝寶林等[2]對553例涂陽肺結核患者的痰標本同時進行DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗,發(fā)現DNA微陣列芯片法的敏感度、特異度和一致率較高,認為DNA微陣列芯片法適用于對耐多藥肺結核患者的輔助診斷。
筆者將DNA微陣列芯片法應用于結核分枝桿菌的檢測及其對異煙肼和利福平的耐藥性檢測。與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法相比,該法對結核分枝桿菌檢出率高,與之前的研究結果一致[2,6]。分析可能的原因,DNA微陣列芯片法的檢測原理是將標記有熒光分子的PCR擴增產物與芯片上的探針在一定條件下進行雜交反應,不依賴于痰液中結核分枝桿菌的生存狀態(tài),只要有核酸片段便可以進行檢出;而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法依賴于活菌的狀態(tài),受到結核分枝桿菌生命力的影響。
在耐藥性檢測方面,筆者對兩種方法檢測結果均為結核分枝桿菌的620例患者納入分析,采用分層分析的方法比較DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗的檢測結果。以比例法藥敏試驗為標準,DNA微陣列芯片法對異煙肼耐藥性檢測的敏感度與陽性預測值較低,推測與該方法檢測異煙肼耐藥相關基因靶位點較少有一定的關系(博奧生物有限公司晶芯?結核分枝桿菌耐藥基因檢測中異煙肼耐藥靶位點為katG基因315位點AGC→ACC和AGC→AAC兩個突變型,inhA基因啟動子-15位點C→T突變型)。本次研究中 DNA 微陣列芯片對耐多藥及異煙肼、利福平耐藥性檢測均顯示了較高的特異度(均>95.0%)和陰性預測值(均>90.0%),但陽性預測值較低,均與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗保持了很高的一致性(Kappa值均>0.7),這對于耐藥結核病患者的鑒別診斷有重要意義。
綜上所述,DNA微陣列芯片法具有快速、敏感度與特異度高的特點,可用于臨床快速檢測結核分枝桿菌的耐藥株,為臨床診斷、選擇和調整耐藥結核病患者的治療方案提供參考,在積極應對結核病尤其是耐多藥結核病、遏制結核病的傳播等方面有重要意義。