單永梅 王偉炳 王建美
耐多藥結(jié)核病已成為當(dāng)前我國(guó)結(jié)核病防治工作面臨的主要挑戰(zhàn)之一[1]。結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢,目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是先培養(yǎng)后再進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”),在檢測(cè)順利的情況下,至少耗時(shí)2~3個(gè)月。傳統(tǒng)培養(yǎng)加藥敏試驗(yàn)檢測(cè)雖結(jié)果可靠,但費(fèi)時(shí)且不利于患者的早期治療,可能促使耐藥菌株的增多和播散。研究顯示,應(yīng)用DNA微陣列芯片法可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性[2-6]。筆者以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),評(píng)估DNA微陣列芯片法對(duì)涂陽(yáng)患者痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢出情況,及其對(duì)異煙肼和利福平耐藥性檢測(cè)的效果,從而評(píng)估DNA微陣列芯片法的應(yīng)用價(jià)值。
收集2011年1月至2017年5月間在江蘇省灌云縣疾病預(yù)防控制中心登記的814例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本。凡符合下列三項(xiàng)之一者為涂陽(yáng)肺結(jié)核患者:(1)2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性;(2)1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性,肺部影像學(xué)檢查符合活動(dòng)性肺結(jié)核表現(xiàn);(3)1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽(yáng)性,1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性[7]。涂陽(yáng)肺結(jié)核患者中,男627例(77.03%),女187例(22.07%);年齡范圍16~98歲,中位年齡53(30,66)歲。將新發(fā)患者與2、3個(gè)月末痰涂片陽(yáng)性者歸為初治患者;將復(fù)發(fā)、返回、初治失敗、復(fù)治失敗、其他歸類為復(fù)治患者[8];初治涂陽(yáng)患者599例(73.59%),復(fù)治涂陽(yáng)患者215例(26.41%)。
由縣級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室醫(yī)生對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行粗篩,留下合格的標(biāo)本(干酪樣、褐色血痰、含有少量新鮮血液的血痰、黏液痰等)進(jìn)行痰涂片檢查,采用直接痰液涂片鏡檢法檢測(cè)。痰標(biāo)本的收集、涂片、鏡檢報(bào)告、質(zhì)量控制及涂片保存等均嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9]。對(duì)于不合格的標(biāo)本,退回并進(jìn)一步指導(dǎo)患者重新留痰送檢。涂陽(yáng)標(biāo)本統(tǒng)一送市級(jí)結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院做快速診斷、傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗(yàn)。培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司,所有操作與結(jié)果判讀嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和儀器或設(shè)備說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1. 菌懸液制備和稀釋:用接種環(huán)取2~5 mg培養(yǎng)基上的菌落,研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì),配制成1 mg/ml 的菌懸液,梯度稀釋為10-1、10-2和10-4mg/ml。
2. 羅氏培養(yǎng):吸取0.1 ml濃度為10-1mg/ml的菌懸液,分別接種到對(duì)照羅氏培養(yǎng)管及對(duì)硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)兩種藥敏羅氏培養(yǎng)基表面,盡量使菌液均勻鋪滿斜面。接種后的培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn):(1)若PNB(-)和TCH(+),初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌;(2)若PNB(-)和TCH(-),初步鑒定為牛分枝桿菌;(3)若PNB(+)和TCH(+),初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌菌群。羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司,規(guī)格為7 ml/支。
3. 比例法藥敏試驗(yàn):用標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別沾取1滿環(huán)(即0.01 ml)10-2和10-4mg/ml的菌懸液,用劃線法均勻接種至對(duì)照培養(yǎng)管培養(yǎng)基表面和藥敏培養(yǎng)管培養(yǎng)基表面,盡量使菌液均勻鋪滿斜面。接種后的培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。耐藥百分比(%)=(含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù))/(對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù))×100%。耐藥百分比≥1%,報(bào)告耐藥(R);耐藥百分比<1%,報(bào)告敏感(S)。若10-4mg/ml濃度的菌懸液在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)少于20個(gè)菌落,則應(yīng)從對(duì)照管傳代培養(yǎng),重復(fù)試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司,規(guī)格為7 ml/支。
4. 分離培養(yǎng)和藥敏熟練度測(cè)試:分離培養(yǎng)涂陽(yáng)培陰率小于10%,污染率小于5%;比例法藥敏試驗(yàn)操作人員須通過(guò)國(guó)家藥敏熟練度考核測(cè)試。
1.檢測(cè)原理:以臨床樣品中分離的結(jié)核分枝桿菌DNA為模板,運(yùn)用不對(duì)稱PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),由于引物末端標(biāo)記有熒光分子,在擴(kuò)增過(guò)程中待檢測(cè)的DNA分子將被擴(kuò)增為帶有熒光分子的DNA片段。將標(biāo)記有熒光分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針在一定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng),根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,序列匹配的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)探針在芯片上的特定位置排布,可判讀相應(yīng)被測(cè)細(xì)菌信息,從而鑒定出該細(xì)菌的種類與判斷耐藥情況。晶芯?分枝桿菌菌種鑒定系統(tǒng)和晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自北京博奧生物有限公司。
2. 操作步驟:(1)痰標(biāo)本處理。取患者痰液標(biāo)本2~3 ml,加入1~2倍體積現(xiàn)配4% NaOH溶液,振蕩混勻,室溫靜置15~20 min,吸取1 ml上清液于微量離心管中,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min 離心5 min,棄去上清液,再加入1 ml生理鹽水,充分振蕩后,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min離心5 min,棄去上清液。(2)核酸DNA提取。向離心管加入80 ml 核酸提取液,振蕩混勻后轉(zhuǎn)入核酸提取管中,加入上一步經(jīng)處理后的痰液標(biāo)本,用晶芯Extractor TM36核酸快速提取儀振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,離心半徑13.5 cm ,5000 r/min離心1 min。(3)PCR擴(kuò)增:每份樣品進(jìn)行3管PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將PCR擴(kuò)增試劑1、2、3各18 ml分別放入3管,將核酸提取物2 ml依次加入到3個(gè)管中,每管PCR反應(yīng)體系總體積為20 ml。擴(kuò)增條件:37 ℃ 600 s,1個(gè)循環(huán);94 ℃ 600 s,1個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);94 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,10個(gè)循環(huán);72 ℃ 420 s,1個(gè)循環(huán);分別得到PCR產(chǎn)物1、2、3。(4)芯片雜交:將PCR產(chǎn)物1、2、3置于PCR儀中95 ℃變性5 min,隨后立即置于冰水混合物中5 min;按照9 ml雜交緩沖液、3 ml PCR產(chǎn)物1和 3 ml PCR產(chǎn)物2配制雜交混合物R;9 ml雜交緩沖液、3 ml PCR產(chǎn)物1和3 ml PCR產(chǎn)物3配制雜交混合物H。吸取13.5 ml雜交混合物R和雜交混合物H分別經(jīng)蓋片加樣孔加入利福平微陣列(微陣列1或3)和異煙肼微陣列(微陣列2或4)中,迅速蓋上雜交盒并密封,立即放入芯片雜交儀中50 ℃雜交2 h,轉(zhuǎn)速為5 r/min。(5)芯片清洗干燥及結(jié)果判讀:雜交反應(yīng)結(jié)束后,將雜交盒水平取出拆開(kāi),將芯片取出,使用SideWasherTM8芯片洗干儀清洗芯片,使用晶芯?LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯?菌種鑒定檢測(cè)分析系統(tǒng)、晶芯?分枝桿菌藥敏檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)的讀取及結(jié)果判斷。
3. 質(zhì)量控制:試驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作人員進(jìn)行技術(shù)培訓(xùn),對(duì)20份質(zhì)量控制標(biāo)本(結(jié)核分枝桿菌DNA標(biāo)本)進(jìn)行熟練度測(cè)試,符合率為100%。
應(yīng)用EpiData 3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入并進(jìn)行一致性檢驗(yàn),SAS 9.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),評(píng)價(jià)DNA微陣列芯片法的檢測(cè)效能。各項(xiàng)指標(biāo)的計(jì)算方法:敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%;陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。采用Kappa檢驗(yàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià),Kappa值判定標(biāo)準(zhǔn): 0.0~0.20為極低一致,0.21~0.40為一般一致,0.41~0.80為中高度一致,0.81~1.00為完全一致[10]。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
DNA微陣列芯片法對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢出率為86.1%(701/814),高于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的82.4%(671/814),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.81,P<0.05)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),DNA微陣列芯片法檢測(cè)涂陽(yáng)患者結(jié)核分枝桿菌敏感度和特異度分別為92.4%和43.4%,Kappa=0.39,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為88.5%和54.9%,見(jiàn)表1。
DNA微陣列芯片法對(duì)初治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌檢出率為88.5%(530/599),傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的檢出率為88.5%(530/599),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.00,P=1.000)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),DNA微陣列芯片法檢測(cè)初治涂陽(yáng)患者結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為93.4%和49.3%,Kappa=0.43,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.4%和49.3%,見(jiàn)表1。
DNA微陣列芯片法對(duì)復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的結(jié)核分枝桿菌檢出率為79.5%(171/215),高于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的65.6%(141/215),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.52,P<0.05)。以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn),DNA微陣列芯片法檢測(cè)復(fù)治涂陽(yáng)患者結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為88.7%和37.8%,Kappa=0.29,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為73.1%和63.6%,見(jiàn)表1。
814例進(jìn)行傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)的涂陽(yáng)肺結(jié)核患者中,671例檢測(cè)結(jié)果為“結(jié)核分枝桿菌”,43例檢測(cè)結(jié)果為“非結(jié)核分枝桿菌病”,76例(9.3%)為“培養(yǎng)陰性”,24例(2.9%)為“培養(yǎng)污染”,分離培養(yǎng)涂陽(yáng)培陰率小于10%,污染率小于5%,符合質(zhì)量控制要求。對(duì)814例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法與DNA微陣列芯片法結(jié)果進(jìn)行比較,剔除無(wú)效結(jié)果包括傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法中鑒定為非結(jié)核分枝桿菌、培養(yǎng)陰性、培養(yǎng)污染與DNA微陣列芯片法中判定非結(jié)核分枝桿菌(9例)、結(jié)果無(wú)法判讀(87例)、未檢測(cè)到分枝桿菌(17例)等情況,共獲得620例患者的有效結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行分析,見(jiàn)圖1。620例患者中,男470例(75.8%),女150例(24.2%);初治涂陽(yáng)患者495例(79.8%),復(fù)治涂陽(yáng)患者125例(20.2%)。
表1 DNA微陣列芯片法對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)效能(以傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn))
注陽(yáng)性表示檢測(cè)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌;陰性表示檢測(cè)結(jié)果為其他(包括傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法中鑒定為非結(jié)核分枝桿菌、培養(yǎng)陰性、培養(yǎng)污染;DNA微陣列芯片法中判定為非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)果無(wú)法判讀、未檢測(cè)到分枝桿菌等情況)
圖1 進(jìn)行耐藥情況分析的有效患者納入流程圖
以比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),DNA微陣列芯片法檢測(cè)初治涂陽(yáng)患者是否耐多藥的敏感度和特異度分別為90.5%和100.0%,Kappa=0.97,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為100.0%和99.6%;檢測(cè)復(fù)治涂陽(yáng)患者是否耐多藥的敏感度和特異度分別為69.6%和98.0%,Kappa=0.74,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為88.9%和93.5%;檢測(cè)初治涂陽(yáng)患者是否對(duì)異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.7%和96.4%,Kappa=0.71,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為69.8%和97.7%;檢測(cè)復(fù)治涂陽(yáng)患者是否對(duì)異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為71.9%和95.7%,Kappa=0.71,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為85.2%和90.8%;檢測(cè)初治涂陽(yáng)患者是否對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為84.6%和98.3%,Kappa=0.77,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為73.3%和99.1%;檢測(cè)復(fù)治涂陽(yáng)患者是否對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89.3%和96.9%,Kappa=0.86,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為89.3%和96.9%,見(jiàn)表2。
實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌方法的優(yōu)劣是控制耐藥疫情的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的耐多藥肺結(jié)核診斷方法是對(duì)患者的痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn),一般需要2~3個(gè)月時(shí)間得到結(jié)果,不能解決耐多藥肺結(jié)核患者的早期診斷問(wèn)題,在傳播的過(guò)程中加劇了耐藥結(jié)核病的發(fā)展。近10年來(lái),結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢(shì)[11-12],異煙肼和利福平作為抗結(jié)核一線藥物,其耐藥性檢測(cè)對(duì)于臨床結(jié)核病藥物治療具有重要意義[13]。新型的分子檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的熱點(diǎn)技術(shù)[14],DNA微陣列芯片法作為一種高通量自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù),能為臨床耐藥結(jié)核病的篩查與防治提供良好的技術(shù)支持[15]。
表2 DNA微陣列芯片法對(duì)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者耐藥情況的檢測(cè)效能(以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn))
2013年,劉亞芹等[5]通過(guò)DNA微陣列芯片法和比例法同時(shí)對(duì)54株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行異煙肼和利福平的耐藥性檢測(cè),對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn),DNA微陣列法對(duì)異煙肼和利福平的耐藥檢測(cè)結(jié)果與比例法的符合率分別為75.00%和91.00%,認(rèn)為DNA微陣列芯片法適用于臨床一線對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌的快速篩查。2014年,郝寶林等[2]對(duì)553例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DNA微陣列芯片法的敏感度、特異度和一致率較高,認(rèn)為DNA微陣列芯片法適用于對(duì)耐多藥肺結(jié)核患者的輔助診斷。
筆者將DNA微陣列芯片法應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)及其對(duì)異煙肼和利福平的耐藥性檢測(cè)。與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法相比,該法對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢出率高,與之前的研究結(jié)果一致[2,6]。分析可能的原因,DNA微陣列芯片法的檢測(cè)原理是將標(biāo)記有熒光分子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針在一定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng),不依賴于痰液中結(jié)核分枝桿菌的生存狀態(tài),只要有核酸片段便可以進(jìn)行檢出;而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法依賴于活菌的狀態(tài),受到結(jié)核分枝桿菌生命力的影響。
在耐藥性檢測(cè)方面,筆者對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為結(jié)核分枝桿菌的620例患者納入分析,采用分層分析的方法比較DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn),DNA微陣列芯片法對(duì)異煙肼耐藥性檢測(cè)的敏感度與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低,推測(cè)與該方法檢測(cè)異煙肼耐藥相關(guān)基因靶位點(diǎn)較少有一定的關(guān)系(博奧生物有限公司晶芯?結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)中異煙肼耐藥靶位點(diǎn)為katG基因315位點(diǎn)AGC→ACC和AGC→AAC兩個(gè)突變型,inhA基因啟動(dòng)子-15位點(diǎn)C→T突變型)。本次研究中 DNA 微陣列芯片對(duì)耐多藥及異煙肼、利福平耐藥性檢測(cè)均顯示了較高的特異度(均>95.0%)和陰性預(yù)測(cè)值(均>90.0%),但陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低,均與傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)保持了很高的一致性(Kappa值均>0.7),這對(duì)于耐藥結(jié)核病患者的鑒別診斷有重要意義。
綜上所述,DNA微陣列芯片法具有快速、敏感度與特異度高的特點(diǎn),可用于臨床快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥株,為臨床診斷、選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病患者的治療方案提供參考,在積極應(yīng)對(duì)結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病、遏制結(jié)核病的傳播等方面有重要意義。