新型膠顆粒芯片技術(shù)檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究

蘇丹 李強(qiáng) 車南穎 歐喜超 趙冰 趙雁林 黃海榮

結(jié)核病(TB)是全球第九大致死疾病，是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織[1]報(bào)告僅2016年全球就有1040萬例新發(fā)肺結(jié)核患者，其中有49萬例耐多藥結(jié)核病患者，耐多藥結(jié)核病仍然是全球重大公共衛(wèi)生危害之一。因此，及早正確診斷結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病對于治療和預(yù)防這種高度傳染性疾病具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查方法如萋-尼(Z-N)染色鏡檢的敏感度較低(60%)[2]，容易對患者造成漏診；BACTEC MGIT 960快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)(簡稱“MGIT 960”)液體培養(yǎng)試驗(yàn)需要1～2周的時(shí)間才能報(bào)告結(jié)果，同時(shí)液體培養(yǎng)試驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)室硬件和人員能力也都有較高的要求[3-4]，限制了該方法的廣泛推廣應(yīng)用。通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性，耗時(shí)較長(約2～3個(gè)月)，不能滿足臨床醫(yī)生對患者及時(shí)診斷、早期合理治療的需要。近些年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的分子檢測技術(shù)可有效檢測痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性，檢測方便快捷且敏感度較高。新型膠顆粒芯片為低密度膠顆粒芯片，突破了一般芯片二維界面的局限性，通過提供三維反應(yīng)空間，使得在新型膠顆粒芯片上可以進(jìn)行更加有效的分子間反應(yīng)，同時(shí)每個(gè)膠顆粒里可以裝載不同的反應(yīng)試劑，更加靈活[5-6]。新型膠顆粒芯片技術(shù)[TruArray膠顆粒芯片(Gel element arrays)，簡稱為“TruArray芯片”]用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測，通過檢測最常見的rpoB和katG/inhA耐藥基因是否突變，確定結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性，可以在6 h內(nèi)自動報(bào)告檢測結(jié)果[7]。本研究通過該方法檢測149例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，檢測是否含有結(jié)核分枝桿菌及其對利福平和異煙肼的耐藥性，初步分析該技術(shù)的檢測效能，探討其在我國臨床結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用價(jià)值。

對象和方法

一、研究對象和試劑

1．研究對象：選取2016年8月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院就診的所有疑似肺結(jié)核患者，共149例，提供149份痰標(biāo)本。

2. 試劑：TruDx 2100 試劑盒購自美國Akonni公司，GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)試劑盒購自美國Cepheid公司，MGIT 960液體培養(yǎng)管和藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)檢測試劑盒均來自美國BD公司。

二、研究方法

1．痰標(biāo)本處理：痰標(biāo)本采用N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH(NALC-NaOH)消化液處理，使用磷酸鹽緩沖液中和并離心(3000×g、8～10 ℃ 離心15～20 min)后，傾倒磷酸鹽緩沖液并重懸菌液沉淀至2 ml，分裝2份分別進(jìn)行MGIT 960快速液體培養(yǎng)和GeneXpert檢測。

2．MGIT 960培養(yǎng)法和藥敏試驗(yàn)：加入0.5 ml處理后的痰標(biāo)本至MGIT 960培養(yǎng)管(含0.8 ml OADC營養(yǎng)添加劑和抑菌劑)中進(jìn)行培養(yǎng)，孵育42 d，實(shí)時(shí)監(jiān)測并讀取結(jié)果[3-4]。對培養(yǎng)陽性鑒定為MTBC的菌株，按照操作手冊要求將其加入含有利福平(1 μg/m1)和異煙肼(0.1 μg/m1)藥物的培養(yǎng)管中，進(jìn)行利福平和異煙肼的耐藥性檢測[8-9]。

3. GeneXpert檢測：將GeneXpert試劑盒配套的處理液加入到含有NALC-NaOH處理后痰標(biāo)本的離心管中，渦旋振蕩后靜置15 min，將處理后樣品由加樣孔緩慢加入到反應(yīng)盒內(nèi)。然后上機(jī)，反應(yīng)2 h后讀取結(jié)果[8,10]。

4．TruArray芯片檢測：使用TruTip純化裝置和TruPrep自動化樣本制備儀(Akonni Biosystems)進(jìn)行核酸提取和純化，每次運(yùn)行能夠同時(shí)處理8個(gè)樣品。取40 μl液化緩沖液加入到500 μl痰標(biāo)本中并在56 ℃的水浴中加熱20 min，將液化的樣品轉(zhuǎn)移到樣品裂解管，隨后將樣品裂解管放入自動化樣本制備儀，通過軟件啟動程序運(yùn)行，核酸提取自動完成后，吸取16.8 μl DNA與63.2 μl制備的MTB多重PCR反應(yīng)液(Akonni)混合，然后將裝載的微陣列置于Bioer GeneTouch平板熱循環(huán)儀(杭州博日科技有限公司)上，并進(jìn)行以下擴(kuò)增和雜交程序：30個(gè)循環(huán)的降落PCR(第1個(gè)循環(huán)，89 ℃變性45 s，60 ℃退火1 min，第30個(gè)循環(huán)為55 ℃退火)，在65 ℃進(jìn)行30 s延伸，20個(gè)循環(huán)的PCR(89 ℃變性45 s，55 ℃退火60 s和65 ℃延伸30 s)，最終55 ℃雜交3 h。雜交后，用1000 μl雜交洗滌緩沖液洗滌微陣列，然后離心(200×g、離心1 min)以干燥微陣列。使用具有自動軟件分析的TruDx?成像儀對干燥的微陣列成像，儀器自動報(bào)告結(jié)果。

5．測序：采用16S rRNA基因測序?qū)σ后w培養(yǎng)陽性菌株進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定，rpoB基因測序用于利福平耐藥基因檢測，katG和inhA基因測序用于異煙肼耐藥基因檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物由天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測序，序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(http://blast.Ncbi.nlm．nih．gov/Blast.cgi)做同源性比較或多序列比對，引物序列見表1。

表1 菌種鑒定及耐藥基因測序引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算敏感度和特異度，評價(jià)新型膠顆粒芯片技術(shù)檢測對結(jié)核分枝桿菌、利福平和異煙肼耐藥性的檢測效能。各種檢測方法的檢出率比較采用配對卡方檢驗(yàn)(McNemar test)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Kappa一致性檢驗(yàn)，對TruArray芯片與耐藥基因測序檢測利福平和異煙肼耐藥的一致性進(jìn)行比較，Kappa值>0.75代表一致性好。

結(jié) 果

一、MGIT 960液體培養(yǎng)、GeneXpert和TruArray芯片對結(jié)核分枝桿菌檢出率的比較

149份痰標(biāo)本中，54份標(biāo)本MGIT 960液體培養(yǎng)陽性，6株培養(yǎng)陽性菌株經(jīng)測序鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(5株為胞內(nèi)分枝桿菌，1株為堪薩斯分枝桿菌)，液體培養(yǎng)對結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率為32.2%(48/149)；81份標(biāo)本GeneXpert結(jié)核分枝桿菌檢測陽性，1份GeneXpert檢測陽性標(biāo)本經(jīng)測序鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌，GeneXpert對結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率為53.7%(80/149)；86份標(biāo)本TruArray 芯片結(jié)核分枝桿菌檢測陽性，1份TruArray 芯片檢測陽性標(biāo)本經(jīng)測序鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌，TruArray芯片對結(jié)核分枝桿菌的陽性檢出率為57.0%(85/149)。TruArray芯片和GeneXpert兩種方法陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.34，P=0.560)，但TruArray芯片檢測陽性檢出率高于液體培養(yǎng)(χ2=18.59，P<0.01)。

二、 TruArray芯片對痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢測

以MGIT 960液體培養(yǎng)聯(lián)合測序鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為97.9%(47/48)和61.4%(62/101)。以GeneXpert檢測聯(lián)合測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為97.5%(78/80)和88.4%(61/69)(表2)。

三、 TruArray芯片檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥性分析

共對48株分離的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)，5份標(biāo)本TruArray芯片利福平耐藥檢測失敗，以液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為91.7%(11/12)和96.8%(30/31)。81份GeneXpert檢測陽性標(biāo)本，2份標(biāo)本GeneXpert利福平耐藥檢測失敗，11份標(biāo)本TruArray芯片利福平耐藥檢測失敗，以GeneXpert檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為85.0%(17/20)和97.9%(47/48)。對43株分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行rpoB耐藥基因測序，與測序結(jié)果比較，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為92.3%(12/13)和100.0%(30/30)(表3)，TruArray芯片利福平耐藥檢測與rpoB耐藥基因測序結(jié)果的一致性較高(Kappa值=0.9)。

表2 TruArray芯片檢測MTB的效能

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%

表3 TruArray芯片檢測MTB對利福平耐藥的效能

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%

四、 TruArray芯片檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性分析

共對48株分離的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行液體藥敏試驗(yàn)，2份標(biāo)本TruArray芯片異煙肼耐藥檢測失敗，以液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%(11/14)和93.8%(30/32)。對46株分離培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行katG和inhA耐藥基因測序，與測序結(jié)果比較，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為100.0%(11/11)和94.3%(33/35)，TruArray芯片異煙肼耐藥檢測與katG和inhA耐藥基因測序結(jié)果的一致性較高(Kappa值=0.9)(表4)。

討 論

目前，越來越多的新檢測技術(shù)可進(jìn)行結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的早期診斷和鑒定，每種檢測技術(shù)各有利弊[11-12]。本研究評估的新型膠顆粒芯片技術(shù)，通過使用自動化核酸提取方法，將常規(guī)的核酸提取步驟(裂解、吸附、洗脫)整合在一個(gè)吸頭上，4 min內(nèi)完成DNA核酸樣品的快速提取，操作簡單方便。通過使用全自動移樣器還可進(jìn)行核酸樣品的批量提取，實(shí)現(xiàn)樣品準(zhǔn)備工作的快速和自動化[13]。TruArray芯片中的每個(gè)膠顆粒都是一個(gè)獨(dú)立的生物傳感器并能支持獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)，并在密封芯片內(nèi)集成了擴(kuò)增、雜交、洗脫、熒光讀取等功能。由于芯片的密封性和高集成性，降低了擴(kuò)增產(chǎn)物污染，保證結(jié)核分枝桿菌及耐藥檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本研究結(jié)果表明，TruArray芯片對痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的檢出率高于液體培養(yǎng)試驗(yàn)，以液體培養(yǎng)試驗(yàn)聯(lián)合測序鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的特異度僅為61.4%。由于TruArray芯片以及GeneXpert檢測和其他分子檢測一樣，僅能檢測結(jié)核分枝桿菌的DNA，檢測陽性不能區(qū)分是活菌還是死菌，但液體培養(yǎng)陽性能證明標(biāo)本中有活菌存在；本研究液體培養(yǎng)陽性率較低，可能由于筆者使用凍存的痰標(biāo)本，降低了分離培養(yǎng)的陽性率。

表4 TruArray芯片檢測MTB對異煙肼耐藥的效能

注敏感度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異度=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%

GeneXpert檢測是世界衛(wèi)生組織推薦的結(jié)核分枝桿菌分子生物學(xué)檢測方法，有大量研究表明該方法可以簡單快速地診斷結(jié)核病及利福平耐藥結(jié)核病[10]。本研究證明，TruArray芯片與GeneXpert檢測效能相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)1份GeneXpert結(jié)核分枝桿菌檢測陽性標(biāo)本經(jīng)測序鑒定為胞內(nèi)分枝桿菌，GeneXpert檢測結(jié)果為極低，利福平耐藥檢測結(jié)果為敏感；另有1份TruArray芯片結(jié)核分枝桿菌檢測陽性標(biāo)本經(jīng)測序鑒定也為胞內(nèi)分枝桿菌，利福平和異煙肼耐藥檢測失敗，兩份標(biāo)本均涂片鏡檢陽性，推測可能是由于所檢樣本為結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌混合感染，但胞內(nèi)分枝桿菌所占比例較高且報(bào)告時(shí)間較早，導(dǎo)致培養(yǎng)試驗(yàn)僅分離出胞內(nèi)分枝桿菌所致。

對于TruArray芯片結(jié)核分枝桿菌檢測陽性的標(biāo)本，還可進(jìn)一步檢測其對利福平和異煙肼的耐藥性，而目前GeneXpert檢測僅能對利福平的耐藥性進(jìn)行檢測，以液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為91.7%和96.8%，與耐藥基因測序結(jié)果比較，TruArray 芯片檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為92.3%和100.0%， TruArray芯片利福平耐藥檢測與rpoB耐藥基因測序結(jié)果的一致性較高。以液體藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，TruArray芯片檢測異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%和93.8%，造成敏感度較低的原因，可能是由于該檢測方法僅檢測兩個(gè)主要的異煙肼耐藥相關(guān)基因，分別是katG和inhA基因，這2個(gè)基因與異煙肼耐藥相關(guān)性僅為70%左右[14]，通過與耐藥基因測序結(jié)果比較，檢測敏感度和特異度分別為100.0%和94.3%。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)目前TruArray芯片檢測利福平耐藥的失敗率較高(18.6%,16/86)，為進(jìn)一步提升TruArray芯片檢測結(jié)果的穩(wěn)定性及異煙肼耐藥檢測的敏感度，還需要進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系并增加相關(guān)異煙肼耐藥基因的檢測。

綜上所述，TruArray芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度較高、檢測周期短、操作相對簡單，同時(shí)可以準(zhǔn)確檢測利福平和異煙肼的耐藥性，對結(jié)核病、尤其是耐多藥結(jié)核病的早期診斷和治療具有十分重要的意義。