siRNA技術(shù)沉默SOCS3對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及作用機(jī)制

王文剛 王 靜 杜建峰 張曉璐 卜秀梅

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，沈陽(yáng)110024)

缺血性心臟病是一種死亡率較高的疾病，嚴(yán)重危害人類的健康，給患者以及家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，通常采用溶栓等手段，迅速恢復(fù)患者冠動(dòng)脈血液的循環(huán)流動(dòng)是臨床治療缺血性心臟病的關(guān)鍵[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，血流重新灌流缺血心肌組織后會(huì)使心臟產(chǎn)生新的損傷，降低心功能、心律失常、心肌頓抑等繼發(fā)性損傷，稱為缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury,IRI)[3]。既往研究表明，心肌IRI與細(xì)胞增殖、凋亡以及氧化損傷、心肌線粒體能量代謝等有關(guān)[4-6]。探明心肌IRI的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制以及如何進(jìn)行有效的防范措施是心血管領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)是SOCS家族的成員之一。研究表明，敲除小鼠SOCS3對(duì)心肌梗死小鼠左心室功能具有顯著影響，提示SOCS3在心臟功能損傷過(guò)程中發(fā)揮作用[7]。為了探究SOCS3基因在缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞中的作用，本研究通過(guò)小分子干擾RNA靶向沉默SOCS3，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞H9C2，進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理[8，9]，觀察其表達(dá)量降低在保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中的作用，為后續(xù)在體探究SOCS3在心肌IRI中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9C2由本實(shí)驗(yàn)室保存，最初購(gòu)買于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、青鏈霉素、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自南京生興公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；siRNA NC或siRNA SOCS3、細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購(gòu)自廣州銳博；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基有限公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海申能博彩生物有限公司；核因子-κB(NF-κB)p65單克隆抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)單克隆抗體、c-Myc單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG二抗購(gòu)自深圳晶美公司。水平電泳儀、電泳槽購(gòu)自北京六一工廠；垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并加入1%的雙抗，放入37℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，顯微鏡下觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，其濃度達(dá)到80%左右，加入胰酶消化，加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，以1∶3或1∶4的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型 顯微鏡下觀察H9C2心肌細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底80%左右，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液清洗2次，缺氧溶液預(yù)先使用混合氣體(含95%N2和5%CO2)飽和處理1 h；吸取適量缺氧溶液加入細(xì)胞中，置于95%N2和5%CO2的37℃密閉容器中培養(yǎng)3 h；棄去缺氧溶液，PBS緩沖液清洗2次，復(fù)氧灌注液提前使用95%O2和5%CO2飽和處理60 min，置于95%O2和5%CO2的37℃密閉容器中復(fù)氧培養(yǎng)3 h。

1.2.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 H9C2心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，穩(wěn)定傳代后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將H9C2心肌細(xì)胞分為4組，對(duì)照組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+siRNA NC組、缺氧/復(fù)氧+siRNA SOCS3組。轉(zhuǎn)染前24 h，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入胰酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)，將細(xì)胞調(diào)整為5×105個(gè)加入6孔板中培養(yǎng)，吸取2 ml完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞豐度達(dá)到80%～90%開始轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，稀釋A液：將0.8～1.0 μg質(zhì)粒溶于50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，混合均勻；稀釋B液：將2 μl Lipofectamine 2000溶于50 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min；將A液與B液充分混合，室溫下孵育3 min，形成復(fù)合物；吸取Opti-MEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，每孔細(xì)胞中加入100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基和上述復(fù)合物，輕輕晃動(dòng)混勻，37℃培養(yǎng)4～6 h，移去轉(zhuǎn)染液，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 收集各組5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔；置于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，PBS液沖洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10 μl的CCK-8液，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)下的吸光值(OD值)。

1.2.5細(xì)胞中LDH、MDA、SOD的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，超聲破碎處理后，根據(jù)MDA、SOD檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞中MDA、SOD的水平；收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)LDH活力。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 收集各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，去舊培養(yǎng)基，加入2 ml PBS液沖洗2次；采用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS液沖洗2次，收集3×105個(gè)細(xì)胞；加入500 μl緩沖液重懸細(xì)胞，室溫下加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)輕輕混合均勻，再加入5 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)輕輕混合均勻，此過(guò)程在避光環(huán)境下操作，孵育15 min，1 h內(nèi)置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB相關(guān)蛋白水平 取出各組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，PBS液沖洗3次，每孔細(xì)胞中加入200 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，采用細(xì)胞刮片將細(xì)胞以及裂解液集中至培養(yǎng)孔一側(cè)，轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上裂解完全后，離心，取上清。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，吸取適量的蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴變性10 min。組裝凝膠系統(tǒng)，配置5 ml 10%分離膠和5%積層膠，室溫下凝固30 min。將凝膠放入電泳槽中，加入等量的蛋白樣品，先調(diào)整電壓為80 V，隨后將電壓調(diào)為120 V，電泳至藍(lán)色條帶遷移至玻璃板邊緣，切去多余凝膠，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。選取凝膠大小的PVDF膜先浸泡在甲醛液中10 s，再轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中浸泡5 min，依次加入海綿墊、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙、海綿墊，放入轉(zhuǎn)膜槽中，避免產(chǎn)生氣泡，冰水浴中采用220 mA電流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，三蒸水清洗1次，加入配置好的牛奶封閉液，37℃搖床上孵育1 h；加入一抗稀釋液，4℃垂直搖床孵育過(guò)夜；在洗膜專用盒中清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液，室溫靜置120 min；在洗膜專用盒中清洗3次，每次10 min，根據(jù)化學(xué)發(fā)光劑說(shuō)明書進(jìn)行顯色、曝光，分析目的蛋白與內(nèi)參條帶比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果 結(jié)果如圖1、表1所示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞后SOCS3蛋白的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA NC轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞中SOCS3蛋白的表達(dá)量較缺氧/復(fù)氧組差異不顯著，但siRNA SOCS3轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞顯著降低SOCS3蛋白的水平(P<0.05)，表明缺氧/復(fù)氧+siRNA SOCS3組心肌細(xì)胞降低SOCS3蛋白的表達(dá)主要是由siRNA SOCS3特異性序列引起的，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 結(jié)果如表2所示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧處理H9C2心肌細(xì)胞顯著降低細(xì)胞的增殖活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA NC轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞的增殖活性較缺氧/復(fù)氧組差異不顯著，但siRNA SOCS3轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞顯著增加細(xì)胞的增殖活性(P<0.05)，表明缺氧/復(fù)氧+siRNA SOCS3組心肌細(xì)胞降低SOCS3蛋白的表達(dá)可促進(jìn)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞增殖。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SOCS3蛋白的表達(dá)量Fig.1 Expression of SOCS3 protein after transfected of cellsNote:1.Control group;2.Hypoxia/reoxygenation group;3.Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group;4.Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group.

GroupsSOCS3/β-actinControl group0.266±0.028Hypoxia/reoxygenation group0.784±0.0831)Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group0.756±0.0791)Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group0.271±0.0352)3)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group,2)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group+siRNA NC group,3)P<0.05.

GroupsOD450Control group0.893±0.078Hypoxia/reoxygenation group0.421±0.0451)Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group0.436±0.0471)Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group0.628±0.0671)2)3)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group,2)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group +siRNA NC group,3)P<0.05.

2.3LDH、MDA、SOD的檢測(cè) 結(jié)果如表3所示，與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和細(xì)胞內(nèi)MDA的水平，降低細(xì)胞內(nèi)SOD活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA NC轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH以及細(xì)胞中MDA、SOD活性較缺氧/復(fù)氧組差異不顯著，但siRNA SOCS3轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和細(xì)胞內(nèi)MDA，顯著增加細(xì)胞內(nèi)SOD活性(P<0.05)，提示缺氧/復(fù)氧+siRNA SOCS3組心肌細(xì)胞降低SOCS3的蛋白表達(dá)可抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 結(jié)果如表4所示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧處理H9C2心肌細(xì)胞顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA NC轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞的凋亡率較缺氧/復(fù)氧組差異不顯著，但轉(zhuǎn)染siRNA SOCS3顯著降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)，表明沉默SOCS3可抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB相關(guān)蛋白水平 結(jié)果如表5所示，與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧顯著降低細(xì)胞中NF-κB p65以及下游靶蛋白Cyclin D1、c-Myc蛋白的水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siRNA NC轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，細(xì)胞中NF-κB p65以及下游靶蛋白Cyclin D1、c-Myc的蛋白表達(dá)量較缺氧/復(fù)氧組差異不顯著，但siRNA SOCS3轉(zhuǎn)染缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞顯著上調(diào)NF-κB p65以及下游靶蛋白Cyclin D1、c-Myc的蛋白表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示沉默SOCS3蛋白的表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷的保護(hù)作用與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。見圖3。

GroupsLDH(U/L)MDA(nmol/ml)SOD(U/L)Control group469.327±37.5814.623±0.89736.567±4.238Hypoxia/reoxygenation group862.457±42.3691)12.335±2.1261)15.658±2.9831)Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group841.697±45.1181)13.457±2.6281)16.329±2.4851)Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group535.247±23.5411)2)3)7.259±1.2081)2)3)25.784±4.1261)2)3)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group,2)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group+siRNA NC group,3)P<0.05.

GroupsApoptosis rate(%)Control group3.269±0.385Hypoxia/reoxygenation group18.692±2.1251)Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group19.365±2.4511)Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group8.261±1.2031)2)3)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group,2)P<0.05;compared with hypoxia/reoxygenation group +siRNA NC group,3)P<0.05.

圖2 沉默SOCS3對(duì)缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of silencing SOCS3 on apoptosis of H9C2 cardiomyocytes after hypoxia/reoxygenationNote:1.Control group;2.Hypoxia/reoxygenation group;3.Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group;4.Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group.

Groupsp65/β-actinCyclin D1/β-actinc-Myc/β-actinControl group0.845±0.0781.205±0.1361.163±0.154Hypoxia/reoxygenation group0.251±0.0321)0.523±0.0651)0.489±0.0531)Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group0.248±0.0291)0.554±0.0581)0.501±0.681)Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group0.685±0.0541)2)3)0.967±0.1451)2)3)0.896±0.0921)2)3)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05; compared with hypoxia/reoxygenation group,2)P<0.05; compared with hypoxia/reoxygenation group+siRNA NC group,3)P<0.05.

圖3 沉默SOCS3對(duì)缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞NF-κB相關(guān)蛋白水平的影響Fig.3 Effect of silencing SOCS3 on NF-κB related protein levels in H9C2 cells after hypoxia/reoxygenationNote:1.Control group;2.Hypoxia/reoxygenation group;3.Hypoxia/reoxygenation+siRNA NC group;4.Hypoxia/reoxygenation+siRNA SOCS3 group.

3 討論

臨床治療心肌梗死后心肌缺血的關(guān)鍵是及時(shí)恢復(fù)動(dòng)脈或相關(guān)心肌的血液供應(yīng)，但近年來(lái)研究表明，在恢復(fù)缺血心肌組織的血液灌流時(shí)，不但不能減輕心肌細(xì)胞缺血損傷，反而加重了缺血損傷[10]。臨床上對(duì)于缺血再灌注損傷的機(jī)制進(jìn)行了研究，但目前還沒(méi)有完全有效的治療方案，缺血再灌注損傷成為了臨床治療心血管疾病的難題，引起人們的密切關(guān)注。目前為止，SOCS家族被發(fā)現(xiàn)的成員一共有8個(gè)，該家族成員具有SH2核心結(jié)構(gòu)域和含有40個(gè)氨基酸模塊的保守C端。該家族廣泛存在于機(jī)體多種細(xì)胞中且可被誘導(dǎo)表達(dá)[11]。SOCS3是一種與心血管疾病關(guān)系最密切的蛋白成員之一[12]。在缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞的凋亡是IRI病變的主要形式之一[13，14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺氧復(fù)氧干預(yù)心肌細(xì)胞模擬心肌缺血再灌注，采用RNA干擾SOCS3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA SOCS3后，細(xì)胞中SOCS3蛋白的表達(dá)量顯著降低；沉默SOCS3基因表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性顯著增加，凋亡率顯著降低，表明下調(diào)SOCS3基因表達(dá)有效抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞缺氧導(dǎo)致能量代謝紊亂，心肌細(xì)胞膜損傷；復(fù)氧時(shí)，隨著大量氧的灌入，大量氧自由基生成，造成細(xì)胞膜受損，通透性增加。臨床上通常采用血清心肌酶水平的變化間接反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷的程度。LDH是心肌細(xì)胞的標(biāo)志酶之一[15]。SOD是一種細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，通過(guò)去除超氧陰離子，使機(jī)體避免受到氧自由基的損傷，SOD水平的變化間接反應(yīng)細(xì)胞去除氧自由基的能力[16]。MDA是細(xì)胞氧自由基攻擊細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的反應(yīng)產(chǎn)物，其水平的高低間接反映氧自由基損傷細(xì)胞的程度[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺氧復(fù)氧干預(yù)心肌細(xì)胞時(shí)，LDH、MDA水平顯著增加，SOD顯著下降，心肌細(xì)胞的增殖活性降低，表明缺氧復(fù)氧過(guò)程脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)烈，細(xì)胞損傷增強(qiáng)；靶向沉默SOCS3表達(dá)顯著降低LDH、MDA含量，SOD、細(xì)胞的增殖活性顯著增加，表明沉默SOCS3可能通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路不僅在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，還是心肌細(xì)胞缺血的預(yù)適應(yīng)早期以及延遲性保護(hù)過(guò)程中的重要機(jī)制[18-20]。抑制缺血心肌細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路的活化，其對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用受到阻礙，表明NF-κB信號(hào)通路在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷中具有重要作用。在IRI過(guò)程中，被激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核中，通過(guò)調(diào)控下游靶基因(Cyclin D1、c-Myc)，調(diào)控細(xì)胞的凋亡、炎癥等反應(yīng)[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，缺氧復(fù)氧干預(yù)心肌細(xì)胞后，細(xì)胞中NF-κB p65、Cyclin D1、c-Myc蛋白水平顯著下調(diào)，表明NF-κB信號(hào)通路在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮一定作用；沉默缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中SOCS3基因的表達(dá)，顯著增加NF-κB p65、Cyclin D1、c-Myc蛋白水平，提示沉默SOCS3可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗凋亡的作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，siRNA干擾SOCS3基因能夠增強(qiáng)細(xì)胞氧自由基的清除能力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用，從而保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷。SOCS3基因可能成為解決IRI的潛在靶點(diǎn)，為下一步在體實(shí)驗(yàn)研究SOCS3基因奠定了理論基礎(chǔ)。