IL-12B 基因rs3212227位點多態(tài)性與川崎病及其并發(fā)冠狀動脈損傷的關聯(lián)性研究①

謝 圭 楊作成 劉 琳 詹 霞 曾 萍 何艷娟 成 亮 黃利華 陳淳媛

(中南大學湘雅三醫(yī)院兒科，長沙410013)

川崎病(Kawasaki disease,KD)，又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征，是一種自限性全身性血管炎，以一系列不明原因的癥狀和體征為特點。KD主要侵犯中、小動脈，并以冠狀動脈損傷為主。流行病學調查顯示，KD在各國各地區(qū)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。至今KD發(fā)病機制尚不明確，主要涉及遺傳、免疫及感染三方面的因素[1]。但為何主要侵犯冠狀動脈機制尚不清楚。隨著人類全基因組計劃的完成，單核甘酸基因多態(tài)性與川崎病的相關性亦得到廣泛研究。而IL-12B基因 rs3212227多態(tài)位點已證實與哮喘、炎癥性腸病、Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化等多種自身免疫性疾病相關[2-5]。且國內已經(jīng)有研究表明，其編碼產(chǎn)物IL-12p40對KD的發(fā)生、發(fā)展、對治療的反應及預后方面可能有一定的影響[6]。但該位點多態(tài)性與KD之間是否有關聯(lián)尚未見報道。本研究對湖南地區(qū)IL-12B基因rs3212227位點多態(tài)性進行分析，旨在探討該基因位點多態(tài)性與KD及其并發(fā)CAL之間是否存在關聯(lián)。

1 資料與方法

1.1資料 經(jīng)倫理委員會批準后，父母或其他監(jiān)護人同意病例下納入研究對象。實驗分對照組和KD組。(1)對照組：86例中國湖南省健康體檢的漢族兒童，年齡1歲～7歲，男47例，女39例，排除感染性疾病、心血管疾病、風濕性疾病、腫瘤等，并排除既往KD病史。(2)KD組：選取我院2004年2月～2014年11月期間住院的KD患者83例，其中男51例，女32例，均符合KD診斷標準[7]，所有患兒均為漢族，年齡7個月～7歲，所有患兒入院前均未經(jīng)丙種球蛋白(IVIG)和阿司匹林治療，其中KD合并冠狀動脈損傷的標準為：年齡≤3歲，冠脈內徑>2.5 mm；3歲<年齡≤9歲，冠脈內徑>3 mm；9歲<年齡≤14歲，冠脈內徑>3.5 mm；②某段血管直徑為鄰近段的1.5倍及以上；③管壁明顯不規(guī)則。根據(jù)有無冠狀動脈損傷分為冠狀動脈損傷組(CAL組)和無冠狀動脈損傷組(NCAL組)。

1.2方法

1.2.1標本的收集和處理 患兒于入院第1天在其家長或監(jiān)護人知情同意下，使用一次性采血管(含抗凝劑5%的EDTA-Na2)抽取2 ml靜脈血，立即提取DNA或置于-80℃冰箱保存，2月內提取DNA。

1.2.2基因組DNA的提取 應用Promega DNA提取試劑盒，按照說明書要求提取血液基因組DNA，并進行濃度和純度的測定，置于-80℃冰箱保存。

1.2.3基因多態(tài)性的檢測 應用聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性技術(Polymerase Chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)，鑒定對照組及KD組IL-12B基因 rs3212227位點基因型。上游引物：5′-GATATCTTTGCTGTATTTGTAT-AGTT-3′；下游引物：5′-AATATTTAAATAGCATGAA-GGC-3′(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。PCR反應體系20 μl：模版DNA(約200 ng)，上下游引物各0.4 μl(20 μmol/L)，2×Taq MasterMix 10 μl，去離子水加至20 μl。擴增反應條件為：預變性95℃、5 min后，95℃、30 s→56℃、30 s→72℃、30 s(35個循環(huán))，終末延伸72℃、10 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并于紫外燈下照相，初步鑒定擴增是否成功。隨后進行酶切，酶切反應體系如下：25 μl：10 μl PCR產(chǎn)物，TaqⅠ限制性核酸內切酶0.5 μl，buffer 2.5 μl，加雙蒸水至25 μl，65℃酶切4 h。酶切產(chǎn)物再次進行電泳及照相，判定基因型，記錄結果。隨后隨機選取鑒定結果為AA、AC、CC基因型各1例，PCR產(chǎn)物送檢鉑尚生物技術(上海)有限公司以雙脫氧鏈終止法(Sanger法)進行基因測序，以驗證酶切結果準確性。

1.3統(tǒng)計學方法 直接計數(shù)法計算對照組、KD組IL-12B基因 rs3212227位點基因型以及等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗受試對象的基因型頻率是否符合遺傳平衡。采用χ2檢驗比較對照組與KD組間、NCAL組與CAL組之間基因型及基因頻率的差別。以P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1臨床資料 結果見表1。

2.2IL-12B基因rs3212227位點基因PCR產(chǎn)物擴增結果 血液標本提取所得基因組DNA經(jīng)紫外分光光度儀檢測OD260/OD280。比值為1.7～2.0，皆符合實驗要求。經(jīng)PCR擴增得到IL-12B基因rs3212227位點片段為118 bp，與預期一致(見圖1)。

2.3PCR產(chǎn)物TaqⅠ核酸內切酶酶切后電泳圖 IL-12B rs3212227多態(tài)位點呈A-C二態(tài)，含C等位基因的DNA片段可被TaqⅠ核酸內切酶識別并酶切，而A等位基因無酶切位點，酶切后AA基因型為118 bp一條片段，AC基因型可被部分酶切為118、92、26 bp三條片段，CC基因型被完全酶切為92、26 bp兩條帶。因26 bp片段分子量太小，電泳圖上難以顯示，電泳后，AA基因型呈118 bp一條帶，AC基因型呈118、92 bp兩條帶，CC基因型呈92 bp一條帶。結果與預期一致(見圖2)。

表1川崎病組臨床資料(入院后5d內收集資料)

Tab.1Clinicaldataofkawasakidisease(Alldatawerecollectedwithin5daysafteradmission)

Clinical manifestationCasePercentage(%)Fever83100ESR(ESR>20 mm/h)7691.6Congested or cracked oral mucosa,Strawberry tongue7286.7Changes of limbs7084.3Eye conjunctival congestion6173.5Non-suppurative tumefacion of cervi-cal Lymph node5667.5Polymorphous erythema5467.4CRP(CRP>8 mg/L)5363.9CAL2732.5

2.4直接測序圖 見圖3。

2.5Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測 IL-12B基因rs3212227位點基因型頻率在對照組、KD組分布經(jīng)Hardy-Weinberg平衡吻合度檢測，χ2值分別為3.25、3.63，P>0.05。具有群體代表性。

圖1 IL-12B rs3212227位點PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus IL-12B rs3212227Note:M.DNA Maker;Lane 1-5.The PCR products of locus IL-12B rs3212227 was 118 bp.

圖2 IL-12B基因rs3212227位點PCR產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ酶切后電泳圖Fig.2 TaqⅠ enzyme digestion electrophoretogram of locus IL-12B rs3212227 PCR productsNote:M.DNA Maker；Lane 1.Genotype AA had one stripe of 118 bp;Lane 2,3,5.Genotype AC had 2 stripes,118 bp and 92 bp;Lane 4.Genotype CC had one stripe of 92 bp.

2.6對照組及KD組基因型及等位基因頻率比較 KD組IL-12B基因rs3212227位點AA、AC、CC基因型頻率和A、C等位基因頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2分別為4.095、3.316，P>0.05)。NCAL組與CAL組基因型頻率和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.586、1.254，均P>0.05)(表2)。

圖3 IL-12B 基因rs3212227位點直接測序圖Fig.3 Direct sequencing graph of locus IL-12B rs3212227Note:The arrow pointed to the polymorphism of locus rs3212227.A.Genotype AA；B.Genotype AC；C.Genotype CC.

表2各組中IL-12B基因rs3212227位點多態(tài)性的分布、基因型及等位基因頻率比較

Tab.2Comparisonofpolymorphismdistribution,genotypeandallelefrequencyoflocusrs3212227ofIL-12Bgeneineachgroup

GroupsCaseGenotype[Case(%)]AAACCCAllele[Case(%)]ACControl8630(34.8)48(55.8)8(9.3)108(62.8)64(37.2)KD group8319(22.9)50(60.2)14(16.9)88(53.0)78(47.0)χ24.0953.316P0.1290.069Group NCAL5611(42.3)34(60.7)11(19.6)56(50.0)56(50.0)Group CAL278(29.6)16(59.3)3(10.3)32(59.3)22(40.7)χ21.5861.254P0.4520.263

3 討論

KD是一種自身免疫性血管炎性疾病，兒童常見并發(fā)癥是由于損傷冠狀動脈所致的心肌梗死及心臟性猝死，其發(fā)病機制尚不明確。因此對于能預測其發(fā)病及并發(fā)癥發(fā)生相關因素的探討顯得尤為重要。目前研究已發(fā)現(xiàn)多個基因多態(tài)性可能與KD之間存在相關性[8-15]。IL-12B基因rs3212227位點位于IL-12B的3′非翻譯區(qū)的3′末端，雖該區(qū)域不翻譯，但它可影響基因轉錄的穩(wěn)定性及mRNA多聚嘌呤的長短，進而影響基因的轉錄后翻譯水平，從而對疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響。實驗研究表明，該位點多態(tài)性與血漿IL-12p40水平相關。而IL-12p40可分別與IL-12p35或IL-23p19結合形成IL-12(IL-12p70)或IL-23發(fā)揮生物學作用，亦可以單體和(或)二聚體的形式發(fā)揮作用。IL-12主要通過調節(jié)Th1/Th2間平衡從而在Th1型自身免疫性疾病中處于中心地位[16]；而IL-23主要作用于Th17細胞，在Th17細胞的增殖及穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用并能促進相關細胞因子的產(chǎn)生。IL-23具有廣泛的生物學活性，特別是在自身免疫性疾病發(fā)病過程中起重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，川崎病急性期患兒血清IL-23及Th17、Th17/Treg水平明顯高于穩(wěn)定期患兒，提示IL-23和Th17細胞可能與川崎病的發(fā)病及疾病進展有密切關系[18]。同時IL-12p40可以單體或二聚體形式發(fā)揮生物學活性，其功能不僅表現(xiàn)在可競爭性結合IL-12受體從而抑制IL-12的功能，IL-12p40還可作為巨噬細胞化學趨化因子，促進巨噬細胞的遷移。IL-12p40的過表達促進硅肺的形成。IL-12p40的二聚體p80可通過作用于CD8+T細胞促進抑制排斥反應，并與多個病理性炎癥反應相關，包括硅肺、移植排斥反應、哮喘，并在分枝桿菌模型中起保護作用[19]。目前IL-12B基因rs3212227位點多態(tài)性已經(jīng)在自身免疫性疾病，如銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、糖尿病中得到廣泛研究[2-5]。川崎病是與免疫有關的血管炎癥性疾病，有研究表明，IL-12B的編碼產(chǎn)物IL-12p40血漿水平對KD的發(fā)生、發(fā)展以及對治療的反應及預后可能有一定的影響[6]，因此，IL-12B基因rs3212227位點多態(tài)性可能通過改變IL-12、IL-23及IL-12p40血漿水平及其信號通路，從而在KD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

本研究以來自中國湖南的83例KD患兒及86例對照組為研究對象，臨床資料顯示，KD患兒中冠狀動脈損傷27例，發(fā)生率為32.5%。本例中冠狀動脈損傷發(fā)生率遠較內蒙古兒童中的調查低，高于重慶醫(yī)科大學，與北京兒童醫(yī)院研究相仿，三地報道冠狀動脈損傷發(fā)生率分別為63.2%、23.8%、36%，內蒙古地區(qū)CAL發(fā)生率明顯較其他地區(qū)高，可能是因為，其KD患者大多來自邊遠地區(qū)，缺乏有效的醫(yī)療資源，不能得到及時有效地治療，從而導致其CAL發(fā)生率較高。國內外均有研究表明，及時治療對預防冠狀動脈并發(fā)癥至關重要。本實驗中所收集的KD病例，并發(fā)CAL相對較低，可能與湖南地區(qū)相對較好的醫(yī)療環(huán)境及資源相關。同時北京及重慶的研究均對冠狀動脈損傷做了隨訪，發(fā)現(xiàn)部分冠狀動脈損傷發(fā)生在KD恢復期[20-22]。本研究中，僅針對住院期間KD患者的冠狀動脈損傷情況進行統(tǒng)計，而未進行長期隨訪，亦可能是本研究冠狀動脈損傷發(fā)生率低于其他地區(qū)的原因，但也不排除遺傳及環(huán)境因素的影響。另一方面，本實驗應用PCR-RFLP方法對IL-12B基因 rs321227位點基因型進行鑒定，但未發(fā)現(xiàn)對照組與KD組之間基因型(AA、AC、CC)頻率及等位基因(A、C)頻率差異存在統(tǒng)計學意義。在NCAL組與CAL組之間該位點基因型頻率與等位基因頻率差異亦未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義。這種結果，可能是因為本研究中僅納入湖南地區(qū)兒童，而不同地區(qū)及國家的遺傳差異可能導致不同的結論。且本研究納入病例數(shù)相對較少，這也是一個導致結果差異的重大因素。亦有可能IL-12p40對KD的影響并非通過遺傳因素或單核苷酸基因多態(tài)性產(chǎn)生，又或者并非通過IL-12B基因 rs3212227位點多態(tài)性產(chǎn)生影響，也不排除與IL-12B基因其他位點多態(tài)性有關等，有待進一步研究。故而該位點與KD發(fā)生發(fā)展之間是否存在關聯(lián)性尚需大樣本、多中心的臨床研究，并對冠狀動脈損傷進行長期隨訪。