維生素D3輔助治療兒童重癥哮喘可降低血清TLR4、S100β蛋白水平以及延緩哮喘復(fù)發(fā)①

劉文君 王亞亭 畢良學(xué) 梁 磊

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥230022)

支氣管哮喘(Bronchial asthma,BA)是兒童時期最常見的慢性氣道疾病[1]。其中，重癥哮喘急性發(fā)作尤為緊急，可在數(shù)分鐘或數(shù)小時內(nèi)出現(xiàn)進行性呼吸困難，造成呼吸衰竭，甚至危及生命[2]。由于兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，哮喘造成的缺氧可能會對患兒智力、認知功能造成更為嚴(yán)重的后果[3]。大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、支氣管擴張劑等是臨床治療重癥哮喘的常用方法，但仍有部分患兒癥狀無明顯改善。維生素D是人體必需營養(yǎng)物質(zhì)，除維持血清鈣磷濃度的穩(wěn)定及骨的礦物化等作用外，還具有重要的免疫平衡作用，在呼吸系統(tǒng)中，它可以減輕氣道炎癥，保護呼吸器官[4]。Toll樣受體4(Toll like receptors 4,TLR4)是一種重要的免疫識別受體，在獲得性免疫及天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。有報道稱[5,6]，TLR4的表達可啟動和調(diào)節(jié)氣道炎癥，在支氣管哮喘患者的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。同時，血清TLR4與氣道炎癥情況有良好的正相關(guān)，其水平的高低可直接反映支氣管哮喘患者氣道的炎癥情況。S100β蛋白是鈣調(diào)蛋白家族中的成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可影響神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長、增殖、分化，并維持鈣穩(wěn)態(tài)，對學(xué)習(xí)記憶等發(fā)揮一定作用[7]。有研究證實[8]，由于S100β蛋白生物半衰期僅為2 h，因此，其血清水平可較為及時的反映患者腦損傷的情況，廣泛應(yīng)用于研究新生兒宮內(nèi)窒息等方面。本研究旨在通過比較重癥哮喘患兒使用維生素D3輔助前后的癥狀、肺功能指標(biāo)及血清TLR4、S100β表達水平，探討其治療效果。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取安徽省兒童醫(yī)院呼吸科于2015年7月至2016年5月間收治的96例重癥哮喘兒童，將其隨機分為對照組和觀察組，每組48例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組于2016年制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[1]。既往均有哮喘反復(fù)發(fā)作病史，同時排除心功能不全、氣管腫瘤等其他可能引起喘息的疾病及有維生素D3應(yīng)用禁忌者。本研究經(jīng)安徽省兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并得到參與研究患兒家長的知情同意。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患兒入院后嚴(yán)格遵循《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》進行哮喘管理，均予以持續(xù)性吸氧、止咳、祛痰、平喘及抗感染或解除支氣管痙攣等常規(guī)治療。采用支氣管舒張劑緩解癥狀，之后選用糖皮質(zhì)激素控制氣道炎癥。期間根據(jù)病情控制情況調(diào)整治療方案。觀察組在對照組治療基礎(chǔ)上口服維生素D3(廈門國藥控股星鯊制藥有限公司生產(chǎn))800 U/d；連續(xù)治療9 d，當(dāng)患兒癥狀明顯好轉(zhuǎn)時，可繼續(xù)使用1～2 d。所有患兒于治療初始及治療9 d后檢查臨床治療效果、肺功能指標(biāo)及血清TLR4、S100β蛋白水平。

1.2.2觀察指標(biāo) 采用上海涵飛醫(yī)療器械有限公司提供的日本美能AS-507 肺功能儀測定患兒肺功能，包括1秒鐘用力呼氣量占預(yù)計值百分比(FEV1)、1秒鐘用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、用力呼氣25%時瞬間流速(FEF25%)、用力呼氣50%時瞬間流速(FEF50%)。所有患兒反復(fù)接受測量≥3次，變異率≤5%，取最佳值作為參數(shù)記錄。分別于治療前后采集患兒空腹靜脈血4 ml，抗凝處理后加入TLR4單抗，在室溫下培養(yǎng)15 min；加入紅細胞裂解液避光培養(yǎng)10 min，離心操作、去除血清、加入PBS。輔助利用流式細胞儀，測定平均熒光強度值(MFI)，觀察TLR4表達的變化。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定S100β蛋白水平(美國RD公司)。同時，對患兒進行1年隨訪，觀察其預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1一般情況比較 本研究共納入96例重癥哮喘患兒。兩組男女比例、平均年齡、病程差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2臨床癥狀與體征消失時間 在治療過程中，兩組患兒喘息、氣促、胸悶癥狀、咳嗽和肺內(nèi)哮鳴音的平均消失時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1重癥哮喘患兒的一般信息表(n=96)

Tab.1Generalcharacteristicsofchildrenwithsevereasthma(n=96)

VariableObservationgroup(n=48)Controlgroup(n=48)PGender[n(%)]0.536Male29 (60.4)26 (54.2)Female19 (39.6)22 (45.8)Age(year,x±s)5.9±3.06.1±2.80.219Course of disease(year,x±s)2.9±1.62.7±1.10.137

Note：Chi-square test for categorical variables and independent samplettest for continuous variable.

2.3兩組患兒治療前后肺功能比較 治療前，兩組患兒肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%較治療前均顯著升高，且觀察組上升幅度高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4兩組患兒TLR4水平的比較 兩組患兒治療前血清TLR4表達水平無明顯差異(P>0.05)；與本組治療前相比，兩組患兒治療后TLR4的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1 A、 B，P<0.05)。與對照組治療前后相比，觀察組患兒治療前后TLR4有較大程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1C，P<0.05)。見圖1。

2.5兩組患兒S100β水平的比較 兩組患兒治療前血清S100β表達水平無明顯差異(P>0.05)。與本組治療前相比，兩組患兒治療后S100β的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。與對照組相比，觀察組患兒治療后S100β水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.6兩組患兒哮喘復(fù)發(fā)時間的比較 Kaplan-Meier法生存分析表明，觀察組患兒哮喘平均首發(fā)至復(fù)發(fā)間隔時間(11個月)明顯長于對照組的間隔時間(9個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(log-rank，P<0.05)。見圖3。

Clinical signsand symptomsObservationgroup(n=48)Controlgroup(n=48)P1)Respite4.09±1.153.86±1.010.413Shortness of breath4.16±1.273.95±1.08 0.838Chest tightness6.29±2.056.08±1.390.901Cough8.52±2.646.48±2.480.085Intrapulmonary wheezing6.96±2.116.63±1.640.299

Note：Compared with the control group,1)P<0.05.

PulmonaryfunctionObservation group(n=48)BeforetreatmentAftertreatmentDifference betweenbefore treatment andafter treatmentP1)Control group(n=48)BeforetreatmentAftertreatmentDifference betweenbefore treatment andafter treatmentP2)P3)FEV1(L)1.28±0.332.39±0.401.11±0.480.0111.16±0.261.78±0.380.62±0.420.0410.029FEV1/FVC47.76±3.3074.29±5.5226.53±6.110.00252.02±2.7066.73±4.4114.71±5.090.0130.000FEF25%54.53±10.5275.39±11.7510.86±20.890.00754.93±9.4363.10±11.018.17±13.360.0110.038FEF50%44.83±12.0181.26±12.7336.40±19.600.00041.63±13.0170.97±15.5329.34±17.880.0030.041

Note：1)and 2)comparison in lung function between the before and after the treatment among the observation and control group,respectively;3) comparison for the degree changes in lung function between the observation and control group.

圖1 兩組患兒TLR4水平的比較Fig.1 Level of serum TLR4 in two groups of childrenNote:A.Observation group;B.Control group;C.After treatment in two groups of children (The midline of the box diagram is the median,and the upper and lower sides are quartiles,and the upper and lower lines are 10%-90% quantiles).*.P<0.05.

圖2 兩組患兒S100β水平的比較Fig.2 Level of serum S100β in two groups of childrenNote:A.Observation group;B.Control group;C.After treatment in two groups of children(The midline of the box diagram is the median,and the upper and lower sides are quartiles,and the upper and lower lines are 10%-90% quantiles).*.P<0.05.

圖3 兩組患兒哮喘復(fù)發(fā)時間的比較Fig.3 Comparison of recurrence time of asthma in two groups

3 討論

哮喘可嚴(yán)重影響兒童的身心健康，也給家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔(dān)[1]。重癥哮喘造成平滑肌痙攣、氣道黏膜腫脹、炎性細胞浸潤、分泌物滲出增多[9]，可迅速造成嚴(yán)重缺氧與二氧化碳潴留，其中，后面二者可造成患兒腦損傷、認知功能受損[10]。治療方面，臨床上緩解成人重癥哮喘的癥狀常大劑量使用激素、β受體激動劑等，這些治療方式對兒童存在潛在的副作用，有報道表明，哮喘患兒吸入糖皮質(zhì)激素對骨齡發(fā)育有一定的抑制作用[11]，同時這種對兒童生長的抑制作用不是臨時的[12]。因此，提高哮喘患兒的生活質(zhì)量、改善重癥哮喘患兒的預(yù)后至關(guān)重要。1，25(OH)2D3可通過影響單核細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等免疫細胞，調(diào)節(jié)、平衡免疫功能，發(fā)揮廣譜抗炎作用，在呼吸系統(tǒng)中，通過影響多種細胞的生長和分化參與氣道結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，保護呼吸器官，有研究表明，維生素D3可抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[13-15]。有研究證實[16]，支氣管哮喘患者的肺功能及哮喘控制情況與血清維生素D3的水平有相關(guān)性，兒童時期哮喘、上呼吸道感染的發(fā)生可能與維生素D3缺乏有關(guān)，補充維生素D3水平可降低兩者的發(fā)病率。TLR4在傳導(dǎo)炎癥信號的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達可以活化單核-巨噬細胞，釋放一系列細胞因子引起炎癥反應(yīng)，從而進行免疫調(diào)節(jié)。除了參與介導(dǎo)細菌脂多糖導(dǎo)致的細菌性炎癥反應(yīng)外，TLR4還與哮喘、動脈粥樣硬化等非細菌性炎癥反應(yīng)有關(guān)，因此成為控制炎性反應(yīng)的靶點[17]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的S100β蛋白具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用，可以影響神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長，并對學(xué)習(xí)記憶等發(fā)揮一定作用。另有研究證實[8]，血清S100β蛋白水平能及時反應(yīng)腦損傷，幫助評估缺氧對大腦的損傷情況。本研究可以看出，使用低劑量維生素D3(800 U/d)輔助治療重癥哮喘患兒9 d后，兩組患兒治療后肺功能指標(biāo)FEV1、FEV1/FVC、FEF25%及FEF50%較治療前均有明顯改善(P<0.05)，且觀察組肺功能指標(biāo)改善程度優(yōu)于對照組(P<0.05)，這與Majak[18]及Tachimoto[19]的研究結(jié)果相似。本研究還顯示，兩組患兒治療后血清TLR4、S100β蛋白水平較治療前均降低(P>0.05)，觀察組治療后血清TLR4、S100β蛋白水平低于對照組(P<0.05)，同時，觀察組患兒哮喘平均首發(fā)至復(fù)發(fā)間隔時間(11個月)明顯長于對照組患兒的9個月(P<0.05)?？梢宰C明維生素D3具有抑制氣道炎癥、減輕腦損傷、延長復(fù)發(fā)時間的作用，此作用可能通過抑制肺內(nèi)炎癥因子產(chǎn)生、維持鈣磷平衡實現(xiàn)，但具體作用機制尚不明確，同時由于隨訪時間較短，維生素D3治療兒童哮喘的機制需要更進一步研究證實。

綜上所述，維生素D3輔助治療兒童重癥哮喘可以改善患兒肺功能、抑制氣道炎癥并減輕哮喘造成的腦損傷，同時能夠減緩哮喘的復(fù)發(fā)時間，從而為治療兒童重癥哮喘提供新思路。