二甲雙胍抑制mTOR/HIF-1α通路減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中的Th17細(xì)胞反應(yīng)①

孫雅菲 劉曉倩 侯慧清 田 甜 郭 力

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北省神經(jīng)病學(xué)重點實驗室，石家莊050000)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失進(jìn)而繼發(fā)軸索變性為特征的自身免疫性疾病[1]。MS的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，越來越多的研究表明，抗原特異性Th17細(xì)胞能通過多種免疫反應(yīng)在其中起重要作用[2,3]。二甲雙胍(Metformin，MET)是臨床常用的降糖藥物，除了降糖作用外，它在抗炎、抗氧化中的作用也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)[4,5]，并用于糖尿病的外的其他疾病的實驗研究[6,7]。本研究利用MS的動物模型，觀察給予MET治療是否對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephaomyelitis，EAE),小鼠起保護(hù)作用，并對MET針對Th17細(xì)胞的影響和可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 采用8～10周齡C57BL/6雌性小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)建立EAE模型。將實驗動物隨機(jī)分為對照組、EAE組和MET治療組，每組20只。

1.1.2主要試劑和材料 百日咳毒素(Pertussis toxin,PTX)、二甲雙胍(ENZO corporation)；MOG35-55(西安美聯(lián)生物科技有限公司)；結(jié)核菌素H37Ra(DIFCO公司)；小鼠IL-17A-PE抗體、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)(美國eBioscience)；小鼠IL-17A定量分析酶聯(lián)免疫試劑盒(上海巧伊生物科技有限公司)；HiFiScript first-strand cDNA synthesis kit及UltraSYBR mixture(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)；PCR引物由復(fù)能基因公司合成，引物序列見表1。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 用生理鹽水將MOG35-55稀釋為10 mg/ml終濃度，并按 1∶1等體積加入完全弗氏佐劑充分混合乳化?？乖旌衔镏薪Y(jié)核桿菌H37Ra終濃度為4 mg/ml。再以每只0.1 ml抗原于小鼠背部皮下分4點進(jìn)行注射。免疫當(dāng)天和第2天分別每只小鼠腹腔注射PTX 500 ng，對照組小鼠不作任何處理。

1.2.2藥物干預(yù) MET治療組小鼠自免疫后第1天開始，將MET按100 mg/kg每天給予腹腔注射。對照組及EAE組小鼠同時給予等量的生理鹽水腹腔注射作為對照。

1.2.3發(fā)病動物神經(jīng)功能評分 每日上、下午各2次分別由2名實驗者觀察記錄小鼠體重、神經(jīng)功能評分。評分標(biāo)準(zhǔn)(Knoz評分法)如下：0分無癥狀；1分尾部失去張力；2分后肢力弱；3分后肢癱瘓；4分后肢及前肢癱瘓；5分瀕臨死亡或死亡。

1.2.4組織病理HE染色 于免疫后第20天(發(fā)病高峰期)對各組小鼠脊髓腰膨大組織進(jìn)行病理取材，5 μm切片，HE染色。每只小鼠取不連續(xù)3張組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片5個400×視野中炎性細(xì)胞浸潤情況。HE染色炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無炎性細(xì)胞浸潤；1分，散在炎性細(xì)胞浸潤；2分，血管周圍炎性細(xì)胞浸潤；3分，“血管套袖”形成并累及周圍組織。

1.2.5流式細(xì)胞學(xué)檢測脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例 于免疫后第20天(發(fā)病高峰期)，隨機(jī)在對照組、EAE組和MET治療組各取5只小鼠，無菌條件下脫頸處死，分離小鼠脾臟。用玻璃注射器針芯于200目細(xì)胞篩上將剪碎的脾臟反復(fù)研磨，RPMI1640液沖洗制備細(xì)胞懸液，在其中加入無菌MOG35-55(10 μg/ml)后置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。8 h后加入PMA 50 ng/ml、Ionomycin 500 ng/ml和Brefeldin A 3 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)14 h，按照ebioscience流式檢測方法檢測CD4+IL-17A+細(xì)胞比例。

1.2.6ELISA方法檢測細(xì)胞因子水平 將脾細(xì)胞懸液500 μl加入無菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入無菌MOG35-55(10 μg/ml)溶液置于37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后收集細(xì)胞培養(yǎng)液備用。小鼠摘除眼球取血，靜置后離心分離收集血清備用。按照IL-17A酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書檢測培養(yǎng)上清及血清中蛋白濃度。

1.2.7qPCR檢測mRNA轉(zhuǎn)錄水平 于免疫后第20天(發(fā)病高峰期)分別在各組隨機(jī)取5只小鼠，Trizol提取脾組織中總RNA，HiFiScript first-strand cDNA synthesis kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用實時定量PCR檢測技術(shù)檢測IL-17、RORγt、低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia ducible factors-1 alpha,HIF-1α)mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以β-actin作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.2.8WB檢測核糖體S6激酶(Ribosomal S6 protein kinase 1,S6K1)、pS6K1、HIF-1α蛋白表達(dá) 于免疫后第20天(發(fā)病高峰期)分別在各組隨機(jī)取5只小鼠，分離脾組織，提取脾組織中蛋白，應(yīng)用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白在SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，HIF-1α(1∶500)，S6K1(1∶1 000)，pS6K1(1∶200)，β-actin(1∶3 000)抗體孵育，PVDF膜在Odyssey Infrared Imaging System 掃描成像系統(tǒng)成像保存。用軟件Image J測出目的蛋白條帶灰度相對值，與對應(yīng)內(nèi)參對比得出比值。

表1RORγt、IL-17A和HIF-1α引物序列

Tab.1RORγt，IL-17andHIF-1αoligonucleotideprimersusedforreal-timePCR

GeneForward primerReverse primerRORγt5'-GGTCCAGACAGCCACTGCATTC-3'5'-GGTGCGCTGCCGTAGAAGGT-3'IL-17A5'-CAACCGTTCCACGTCACCCT-3'5'-CCAGCTTTCCCTCCGCATT-3'HIF-1α5'-TGAACATCAAGTCAGCAACG-3'5'-CACAAATCAGCACCAAGCAC-3'

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評分比較 整個實驗過程中對照組小鼠均未發(fā)病。EAE組和MET治療組小鼠免疫后出現(xiàn)不同程度的被毛不光滑、食欲減退，于免疫后第10天左右，體重下降，繼而出現(xiàn)程度不同的尾部無力、單或雙后肢無力、截癱，甚至四肢癱。EAE組發(fā)病率100%，而MET治療組發(fā)病率76%，較EAE組發(fā)病率減低(P<0.05)。MET組小鼠發(fā)病時間較EAE組小鼠推遲[(15.25±1.48)d vs(12.40±1.83)d，P<0.05]。兩組具體神經(jīng)功能評分比較見圖1。

2.2MET減輕EAE小鼠脊髓組織中炎性細(xì)胞浸潤 發(fā)病高峰期，EAE組小鼠脊髓中可見大量炎性細(xì)胞在脊膜、脊髓前角、側(cè)索和灰白質(zhì)交界區(qū)浸潤，并形成大量“血管袖套”。MET治療組炎性細(xì)胞則多分布于小血管周圍及脊膜處，“血管袖套”形成數(shù)量也較EAE組減少(P<0.01)。見圖2。

圖1 EAE組和MET組神經(jīng)功能評分Fig.1 Clinical signs of mice in EAE and MET treat-ment groupNote: Compared with the MET-treatment group,*.P<0.01.

2.3MET減少Th17細(xì)胞的產(chǎn)生和浸潤 應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)比較各組脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例。EAE組較對照組Th17細(xì)胞比例升高[(0.27±0.15)% vs(1.03±0.15)%，P<0.01]。而MET治療組Th17細(xì)胞比例較EAE組減低[(0.41±0.08)% vs(1.03±0.15)%，P<0.01]。見圖3。

2.4MET減少細(xì)胞因子IL-17A生成 ELISA法檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液及血清中IL-17A含量。細(xì)胞培養(yǎng)上清中，EAE組較對照組IL-17A含量增加[(281.17±4.01)pg/ml vs(149.91±15.89)pg/ml]，而MET治療組IL-17A含量較EAE組降低[(226.06±4.01)pg/ml vs(281.17±4.01)pg/ml，P<0.01]。血清中IL-17A含量EAE組較對照組增加[(248.08±8.62)pg/ml vs(169.82±15.86)pg/ml]，MET治療組較EAE組降低[(219.51±14.12)pg/ml vs(248.08±8.62)pg/ml，P<0.01]。見圖4。

圖2二甲雙胍減輕EAE脊髓炎性細(xì)胞浸潤程度

Fig.2METmitigatesinflammationinEAEmice

Note: A，D.Control group；B，E.AZ group；C,F.ET treatment group；compared with the EAE group,#.P<0.01.

圖3 二甲雙胍減輕EAE中Th17細(xì)胞比例Fig.3 MET reduces propotion of Th17 cells in EAE miceNote: A.Control group；B.EAE group；C.MET treatment group.Compared with control group,*.P<0.01;compared with the EAE group,#.P<0.01.

圖4 血清及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A含量Fig.4 Concentration of IL-17A in serum and supernatantsNote: A.Serum；B.Supernatants.Compared with control group,*.P<0.01;compared with the EAE group,#.P<0.01.

圖5 qPCR檢測脾中IL-17A，RORγt轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Expression of IL-17A，RORγt mRNA in spleen tissueNote: Compared with control group,*.P<0.01;compared with the EAE group,#.P<0.01.

2.5MET抑制脾組織中RORγt、IL-17AmRNA轉(zhuǎn)錄 在脾組織中，MET治療組IL-17A轉(zhuǎn)錄水平較EAE組降低[(226.06±4.01)vs(281.17±4.01)，P<0.01]。MET組RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平較EAE組降低[(1.54±0.20)vs(5.73±0.24)，P<0.01]。見圖5。

2.6MET抑制脾組織中S6K1活化及HIF-1α表達(dá) S6K1活化程度用pS6K1/S6K1表示。EAE組較對照組S6K活化程度提高(0.76±0.09 vs 0.46±0.12，P<0.01)。MET治療組較EAE組S6K活化程度降低(0.54±0.05 vs 0.76±0.09，P<0.05)。見圖6。

EAE組與對照組相比，HIF-1α蛋白表達(dá)增加(0.79±0.12 vs 0.49±0.05，P<0.01)。MET治療組較EAE組HIF-1α蛋白表達(dá)降低(0.53±0.07 vs 0.79±0.12，P<0.01)。見圖7。HIF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，EAE組vs對照組(1.87±0.12 vs 0.82±0.11)；MET組vs EAE組(1.37±0.25 vs 1.87±0.12，P<0.01)。見圖7。

圖6 脾中S6K1活化程度比較Fig.6 Degree of S6K1 activation in spleen tissueNote: Compared with control group,*.P<0.01；compared with the EAE group,##.P<0.05.

圖7 脾中HIF-1α蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平Fig.7 Relative levels of HIF-1α expression and mRNA transcripts in spleen tissuesNote: Compared with control group,*.P<0.01;compared with the EAE group,#.P<0.01.

3 討論

MS病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，環(huán)境及遺傳易感性參與疾病的發(fā)生發(fā)展。隨著人們的不斷研究認(rèn)識到抗原特異性Th17細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)在MS和EAE的發(fā)病中起重要作用[2]。Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在多個環(huán)節(jié)參與MS發(fā)病及病理損傷。IL-17可以直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞破壞血腦屏障，促進(jìn)炎性細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，誘導(dǎo)IL-1、IL-6等其他促炎因子生成加重異常免疫反應(yīng)造成對組織的破壞[3,8]。在大量的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)IL-17水平在MS 患者中明顯高于健康人群[9]。

不同的T細(xì)胞亞群具有不同的生物功能，在T細(xì)胞產(chǎn)生、活化、分化和決定功能中細(xì)胞代謝起著重要作用，受到外界刺激活化時，淋巴細(xì)胞的代謝功能方式由靜止時的有氧氧化代謝方式轉(zhuǎn)化為以糖酵解代謝為主的方式[10]。

在維持T細(xì)胞生長及其在抗原刺激下的活化、分化這些生理過程中，哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號途徑起到重要作用，尤其在細(xì)胞代謝水平，對T細(xì)胞功能起到至關(guān)重要的作用。mTOR通過誘導(dǎo)c-Myc、HIF-1α轉(zhuǎn)錄而活化T細(xì)胞中糖酵解這一代謝途徑[11]，還可以通過轉(zhuǎn)錄后修飾促進(jìn)這一代謝方式從而協(xié)調(diào)細(xì)胞生長[12]。同時在T細(xì)胞活化后能量代謝方式轉(zhuǎn)化過程中，共刺激信號CD28對于PI3K/Akt/mTOR途徑的活化是至關(guān)重要的[13]。雷帕霉素可以阻礙T細(xì)胞生長、增殖，使其處于無效能狀態(tài)，就是通過其對于mTORC1的抑制進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)糖酵解而實現(xiàn)的[14]。

HIF-1α是mTOR下游編碼參與糖酵解過程基因的重要的靶分子，對于細(xì)胞適應(yīng)外界能量變化起作用[15]，在T淋巴細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、乳酸脫氫酶等多種糖酵解酶的基因表達(dá)受到HIF-1α的影響[16]。有研究報道HIF-1α在Th17細(xì)胞分化、增殖過程中起到重要作用，而這種作用是通過對細(xì)胞能量代謝方式設(shè)定而達(dá)到的。在HIF-1α功能缺陷的細(xì)胞中，參與糖酵解過程的基因的數(shù)量和功能相對野生型均受到影響，進(jìn)而影響糖酵解代謝過程，影響Th17細(xì)胞分化[16]。

腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)與mTOR在調(diào)節(jié)免疫信號聯(lián)系和細(xì)胞代謝中有相反的作用[17]，AMPK可以通過對TSC2磷酸化，還可以對mTORC1的結(jié)構(gòu)蛋白raptor磷酸化進(jìn)而阻止mTORC1活化。在AMPKα1功能缺陷的T細(xì)胞中可以表現(xiàn)出mTORC1和糖酵解代謝的高活性[18]。同時亦有缺乏AMPK的小鼠胚胎成纖維母細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào)的研究結(jié)果證實這一觀點[19]。

二甲雙胍作為臨床常用的降糖藥物，可以激活A(yù)MPK[20]，也被作為AMPK激活劑在多個實驗研究中使用。正是基于上述現(xiàn)有研究，我們將二甲雙胍應(yīng)用于EAE，觀察其對于EAE小鼠是否具有保護(hù)作用，并探索其可能的保護(hù)機(jī)制。在本研究中應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)EAE小鼠，可以減輕動物發(fā)病的嚴(yán)重程度，推遲動物發(fā)病時間，減少了炎性細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤。給予MET干預(yù)后，在小鼠脾中的Th17細(xì)胞的數(shù)量減少，其分泌的IL-17A降低。我們還應(yīng)用PCR技術(shù)檢測了EAE外周免疫器官脾中Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和其分泌的特征性細(xì)胞因子IL-17A的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，mRNA轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出和蛋白表達(dá)同樣的結(jié)果。mTORC1的激活可以通過檢測S6K1的磷酸化來判定，我們通過檢測S6K1的磷酸化程度來明確二甲雙胍對于mTOR的抑制作用，在實驗中發(fā)現(xiàn)，MET對S6K1的激活程度起到抑制作用，進(jìn)一步說明了其可以降低mTOR的活性。我們又進(jìn)一步檢測了mTOR下游涉及細(xì)胞代謝的HIF-1α的蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄水平，也發(fā)現(xiàn)應(yīng)用MET治療，減少了mTOR下游HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用MET抑制了EAE體內(nèi)的Th17細(xì)胞反應(yīng)，且抑制了脾組織內(nèi)mTOR、HIF-1α的活化和表達(dá)，MET可能通過對細(xì)胞代謝的影響抑制了Th17細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而在EAE疾病發(fā)生和發(fā)展中起到保護(hù)作用。盡管MET對于EAE小鼠的保護(hù)作用可能還涉及其他機(jī)制，我們的實驗從細(xì)胞代謝這一角度出發(fā)，為進(jìn)一步尋找新的干預(yù)免疫反應(yīng)的藥物提供了新的思路和可能的理論基礎(chǔ)。