微小RNA-142-5p對人前列腺癌細胞LNCaP增殖和侵襲的影響

王斌 張志敏 王東 金豐 毛萬里 朱文彥 王閣

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，隨著我國人口老齡化，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[1-2]。對于侵襲性及復(fù)發(fā)性的前列腺癌，目前尚無有效治療方法，尋找新的前列腺癌的藥物治療靶點一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼小RNA，通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等細胞生物學(xué)行為，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。研究miRNA調(diào)控腫瘤細胞的分子機制可能為臨床診斷和治療腫瘤提供更好的策略。miR-142-5p在許多腫瘤研究中都有報道，如結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、腎癌等[5-7]，但在前列腺癌中的報道較少。本研究旨在觀察miR-142-5p對前列腺癌細胞增殖與侵襲的影響，并通過生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因檢測實驗探究miR-142-5p的作用機制。

材料與方法

一、材料

人前列腺癌細胞系LNCaP購于上海信然生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購于杭州四季青生物公司；DMEM培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司；Lipofectamine?3000購于美國Invitrogen公司；miR-142-5p模擬物、對照序列miR-NC和PCR引物購于上海吉瑪公司；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天公司；噻唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司；Transwell小室購于美國Corning公司；雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒購于美國Promega公司；野生型與突變型TOP2A熒光素酶報告基因質(zhì)粒(pGL-4載體)由南京諾唯贊生物科技有限公司設(shè)計并合成；Matrigel基質(zhì)膠和一抗TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH購于美國BD公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購于美國Abcam公司；超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

二、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

采用DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)人前列腺癌細胞系LNCaP。轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的LNCaP細胞接種于6孔板中，每孔接種3×105個，按照Lipofectamine?3000說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分為2組：對照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)和實驗組(轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物)，8 h 后觀察細胞狀態(tài)并更換新鮮DMEM培養(yǎng)液。

三、qPCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中miR-142-5p和TOP2A的表達量

采用Trizol法提取細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別用miR-142-5p和TOP2A引物通過PCR儀擴增檢測細胞中miR-142-5p和TOP2A的表達，以U6和GAPDH作參照。按照qPCR試劑盒說明書建立反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，65 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，反應(yīng)35個循環(huán)。實驗重復(fù)4次，結(jié)果用2-ΔΔCt值表示。miR-142-5p上游引物：5′-GGATCATAAAGTAGAAAGCA-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TOP2A上游引物：5′-ACCATTGCAGCCTGTAAATGA-3′，下游引物5′-GGGCGGAGCAAAATATGTTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

四、流式細胞術(shù)分析細胞周期

收集各組細胞，PBS溶液洗滌2次，加入70%乙醇4 ℃下固定過夜。PBS溶液洗滌2次，加入Rnase A和溴化丙啶染液，4 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

五、MTT法檢測細胞增殖能力

收集各組細胞，按3 000個/孔接種于96孔板，共接種5塊培養(yǎng)板，每孔加200 μl培養(yǎng)液。在每個測量點，每孔中分別加入15 μl 5 mg/ml的MTT試劑，37 ℃再培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，搖床振蕩溶解結(jié)晶，用酶標儀檢測每孔在波長490 nm處的吸光度(A)值。分別檢測培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的細胞增殖能力。

六、Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

用無血清DMEM培養(yǎng)液按5∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，均勻鋪于Transwell小室，37 ℃凝固4 h。將處于對數(shù)生長期的2組細胞消化后，用無血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1.5×105個/ml，在Transwell小室內(nèi)加入200 μl細胞懸液，在Transwell小室外加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，棉簽擦去上層細胞，甲醇室溫固定20 min，結(jié)晶紫染色,室溫染色20 min，清水沖洗、晾干。顯微鏡下每孔隨機取4個視野計數(shù)，取平均數(shù)。

七、生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-142-5p的靶基因

結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，預(yù)測miR-142-5p的靶基因。將野生型TOP2A質(zhì)粒命名為TOP2A 3′ UTR-WT，將突變型TOP2A質(zhì)粒命名為TOP2A 3′ UTR-MUT。將處于對數(shù)生長期的LNCaP細胞接種至24孔板，待孔內(nèi)細胞密度達60%，將miR-142-5p模擬物或miR-NC分別與TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒用Lipofectamine?3000共同轉(zhuǎn)染至LNCaP細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測實驗試劑盒說明書檢測各組細胞熒光活性，以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性的比值反映各組細胞的相對熒光素酶活性。

八、免疫印跡法(Western blot)檢測靶基因的表達

收集細胞，加入蛋白裂解液裂解，提取總蛋白。加入等量蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%封閉液室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育TOP2A、Cyclin E1、CDK2、β-catenin、Vimentin和GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 000)。加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h。滴加超敏ECL發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀拍照。

九、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、LNCaP細胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p的效率

qPCR檢測結(jié)果顯示(圖1)，實驗組和對照組細胞中miR-142-5p的表達量分別為(9.20±0.76)和(1.03±0.13)，實驗組miR-142-5p的表達量是對照組的8.93倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 實驗組和對照組LNCaP細胞中miR-142-5p的表達量(與對照組比較bP<0.01)

二、LNCaP細胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)，與對照組比較，實驗組處于G0/G1期的細胞數(shù)量明顯增加，而處于S期的細胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細胞LNCaP從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變。

圖2 miR-142-5p對LNCaP細胞周期的影響(與對照組比較aP<0.01，bP<0.01)

三、LNCaP細胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示(圖3)，實驗組LNCaP細胞在轉(zhuǎn)染后第4、5天的A值低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04，P=0.004)，表明miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細胞LNCaP的增殖。在第1、2、3天的A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 實驗組和對照組LNCaP細胞增殖能力比較(與對照組比較aP<0.05，bP<0.01)

四、LNCaP細胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對細胞侵襲的影響

如圖4所示，實驗組和對照組細胞中穿膜細胞數(shù)分別為(72.83±10.76)和(158.30±19.71)個。與對照組比較，實驗組穿膜細胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，miR-142-5p一定程度上抑制前列腺癌細胞LNCaP的侵襲。

圖4 實驗組和對照組LNCaP細胞侵襲能力比較(與對照組相比bP<0.01)

五、生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、miRecords及miRWalk的分析，預(yù)測miR-142-5p的靶基因為TOP2A，具體的結(jié)合序列見圖5。

圖5 miR-142-5p與TOP2A 3′-UTR互補結(jié)合的序列

六、miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合驗證

與TOP2A 3′ UTR-WT相比，TOP2A 3′ UTR-MUT由序列“ACUUUAU”突變?yōu)椤癠GAAAUA”。將miR-142-5p模擬物或miR-NC分別與TOP2A 3′ UTR-WT或TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LNCaP細胞中，采用雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測相對熒光素酶活性，以檢驗miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合。如圖6所示，miR-142-5p可明顯抑制TOP2A 3′ UTR-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的相對熒光素酶活性，而對TOP2A 3′ UTR-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的相對熒光素酶活性無影響，表明miR-142-5p可靶向結(jié)合TOP2A基因。

七、LNCaP細胞轉(zhuǎn)染miR-142-5p對TOP2AmRNA表達的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后實驗組LNCaP細胞中TOP2A mRNA的表達量(0.26±0.08)顯著低于對照組(1.00±0.07)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

八、Western blot檢測TOP2A蛋白的表達

為進一步探討miR-142-5p在LNCaP細胞中的作用機制，采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物48 h后TOP2A蛋白、細胞周期相關(guān)蛋白、細胞侵襲性相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組TOP2A表達水平降低，細胞周期相關(guān)蛋白如Cyclin E1、CDK2表達降低，細胞侵襲性相關(guān)蛋白β-catenin表達升高，Vimentin蛋白表達降低(圖7)。

1：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-MUT；2：miR-142-5p+TOP2A 3′ UTR-WT；3：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-MUT；4：miR-NC+TOP2A 3′ UTR-WT

圖6 雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-142-5p與TOP2A的靶向結(jié)合(與1相比bP<0.01)

圖7 轉(zhuǎn)染miR-142-5p模擬物對TOP2A蛋白及相關(guān)蛋白表達的影響

討 論

研究前列腺癌增殖和侵襲的機制對前列腺癌患者的靶向藥物治療具有重要意義[8]。miRNA是一種長約19～25個核苷酸的小分子單鏈RNA，可與靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)配對結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平干擾基因的表達[9-10]。目前，已有多種miRNA如miR-136、miR-181c、miR-204被證明與前列腺癌的形成相關(guān)[11-13]。越來越多的研究顯示，miR-142-5p與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[14-16]。Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)miR-142-5p在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達顯著下調(diào)，miR-142-5p過表達可在體內(nèi)外顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。Lou等[15]發(fā)現(xiàn)miR-142-5p過表達通過抑制肝癌細胞的生長和誘導(dǎo)細胞凋亡，在肝癌中表現(xiàn)為重要的抑癌基因作用。Qin等[16]研究表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞系中，miR-142-5p的表達顯著下調(diào)，miR-142-5p的過表達可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲。以上結(jié)果表明miR-142-5p可能在惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，但miR-142-5p在前列腺癌中的報道較少。

我們利用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法，在前列腺癌細胞LNCaP中過表達miR-142-5p，探討miR-142-5p對前列腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果表明過表達miR-142-5p的LNCaP細胞較對照組增殖和侵襲能力明顯受到抑制，表明miR-142-5p可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。流式細胞術(shù)結(jié)果表明miR-142-5p可阻滯LNCaP細胞G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，這可能是miR-142-5p抑制前列腺癌細胞增殖的主要原因。本研究首先通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TOP2A是miR-142-5p的靶基因。TOP2A基因位于17q12染色體，在染色體結(jié)構(gòu)的保持、染色體分離、DNA復(fù)制等生物學(xué)過程中起重要作用[17]。近年來的研究表明，TOP2A的基因表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤中有高表達的傾向，與腫瘤的惡性生物學(xué)行為及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[17-19]。TOP2A在前列腺癌特別是侵襲性較高的前列腺癌中呈現(xiàn)高表達[19]。TOP2A可能成為前列腺癌患者的藥物治療靶點。雙熒光素酶報告基因檢測實驗進一步驗證了miR-142-5p可直接結(jié)合TOP2A 3′ UTR。本研究顯示，當(dāng)miR-142-5p過表達可下調(diào)TOP2A的蛋白水平。TOP2A蛋白下調(diào)后，細胞周期相關(guān)蛋白如Cyclin E1、CDK2表達降低，表明細胞周期受到顯著阻滯。細胞侵襲性相關(guān)蛋白β-catenin表達升高，Vimentin蛋白表達降低，表明細胞侵襲性下降。miR-142-5p對前列腺癌細胞增殖和侵襲的調(diào)控可能是通過抑制TOP2A蛋白實現(xiàn)的。本研究的不足之處在于沒有檢測臨床前列腺癌組織標本中miR-142-5p的表達量，我們下一步將通過收集臨床前列腺癌組織標本和患者臨床隨訪信息，探討miR-142-5p與前列腺癌患者診療、預(yù)后的相關(guān)性。

總之，本研究結(jié)果表明，miR-142-5p與TOP2A存在靶向關(guān)系，miR-142-5p可通過靶向調(diào)控TOP2A，阻滯前列腺癌細胞LNCaP的細胞周期，抑制細胞的增殖與侵襲，說明miR-142-5p在前列腺癌中為抑癌基因，有望在前列腺癌的分子治療中發(fā)揮特異性作用。