聚磷腈微球搭載生長因子時間緩釋對骨髓間充質(zhì)干細胞粘附和增殖的影響

任博 胡曉青 程錦 史尉利 趙逢源 楊朋 余慧鐳 石媛媛 敖英芳

北京大學(xué)第三醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

北京市運動醫(yī)學(xué)關(guān)節(jié)傷病重點實驗室（北京100191）

不斷創(chuàng)新的組織工程技術(shù)是臨床方法治療軟骨損傷的有力支持[1]。骨髓來源間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能并且易獲得、易擴增，是軟骨修復(fù)中比較理想的種子細胞來源[2，3]。在促進細胞增殖和粘附的研究中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β超家族）的表達不僅涉及到細胞黏附分子的激活和整合，其信號受體的調(diào)節(jié)在干細胞增殖和分化過程中同樣非常重要[4]。而目前控釋領(lǐng)域已經(jīng)出現(xiàn)許多可以多種生物活性因子緩釋的復(fù)雜控釋系統(tǒng)[5]，通過聯(lián)合緩釋策略能夠激活眾多信號傳導(dǎo)通路共同調(diào)控細胞增殖從而促進更好的組織工程治療效果。在這其中上調(diào)合成代謝的胰島素樣生長因子（IGF-1）在促進細胞增殖和軟骨基質(zhì)合成過程有明顯的促進作用[6]，我們希望建立雙重釋放TGF-β1和IGF-1實現(xiàn)不同的釋放動力學(xué)特征。

在大多數(shù)緩釋生長因子的策略中，多種生長因子共同釋放難以完全超越單一生長因子釋放的優(yōu)勢，需要改進生長因子隨時間變化的表達[7]。最近相關(guān)的應(yīng)用進展特別強調(diào)在釋放方式中增加時間控制[8，9]。本研究使用的生物可降解聚膦腈在結(jié)構(gòu)和性能上有著明顯優(yōu)于其它傳統(tǒng)生物可降解高分子的優(yōu)勢，尤其是功能化改性和調(diào)控相對簡單易行[10]。聚磷腈主鏈由磷氮原子以交替的單雙兩鍵連接而成，其主鏈中兩側(cè)很容易引入不同的功能集團，其側(cè)鏈集團的親疏水性設(shè)計導(dǎo)致不同的降解速率和緩釋特性[11]。因此，我們制備出具有不同側(cè)鏈氨基酸取代比例的聚磷腈微球，根據(jù)其不同降解速率達到時間調(diào)控的多重緩釋策略，并且初步探討其在體外實驗中裝載生長因子通過緩釋作用刺激骨髓間充質(zhì)干細胞粘附和增殖。

1 材料與方法

1.1 制備聚磷腈聚合物

首先制備丙氨酸乙酯溶液、甘氨酸乙酯溶液、氨基乙酯鹽酸鹽和三乙胺四氫呋喃混合物200 ml，在真空250°C下除去未反應(yīng)的殘留并溶于200 ml無水四氫呋喃連續(xù)攪拌，然后在丙氨酸乙酯溶液中加入在四氫呋喃200 ml[12]。氨基酸酯鹽酸鹽分別和三乙胺按1∶2.3的比例分散于250 ml四氫呋喃中回流6小時，冷卻后過濾去除不溶物。在持續(xù)攪拌下將丙氨酸乙酯溶液緩慢加入上述溶液中。降至室溫后抽濾除去反應(yīng)中生成的三乙胺鹽酸鹽，溶液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后轉(zhuǎn)移到分子量為3500的透析袋中，3天后通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和純化透析得到兩種聚磷腈聚合物，分別為0.076 mol PAGP70和0.038 mol PAGP30聚磷腈聚合物。

1.2 制備緩釋微球

雙乳液法（W1/O/W2）制備聚磷腈多孔微球：分別將0.6 g PAGP70或PAGP30溶于20 ml二氯甲烷（5%w/v）溶液中。然后分別在水溶液中加入40 μg/ml轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）和200 μg/ml胰島素樣生長因子（IGF-1），磁力攪拌以保證溶解完全。再加入2 ml 1%司班80溶液、2 ml去離子水并將配制好的初乳液進行超聲處理（功率200 W/3min）,然后在準備攪拌的燒杯中加入200 ml 1%的PVA溶液，2 ml 10%吐溫60溶液，攪拌1000轉(zhuǎn)/分，待溶劑揮發(fā)4小時后停止攪拌。去離子水洗滌、過濾后再離心，如此反復(fù)操作3～5遍，直至將多于的PVA清除。最后放到冷干機中干燥24 h以上并收集微球粉末待用?？瞻孜⑶蚴褂猛ㄖ苽涞患尤肷L因子。

1.3 微球粒徑分布、形態(tài)觀察

取兩種不同聚磷腈聚合物制備微球樣品送離子濺射噴金后用掃描電子顯微鏡觀察（SEM，S-4800型，日立公司）。電鏡下觀察微球的表面形態(tài)，并隨機計數(shù)100個微球的粒徑，從圖像軟件分析測量的微球的直徑并計算出兩種微球的平均粒徑。

1.4 微球緩釋曲線測定

將載生長因子的緩釋微球5 mg加入EP管后混懸于1 ml PBS溶液中，置于37℃搖床震蕩中，分別于各時間點（4小時，1、3、5、7、10、14、21天）高速離心后取上清液1 ml備用，再補充1 ml新鮮PBS后繼續(xù)37°培養(yǎng)，酶聯(lián)免疫儀吸附法（依據(jù)ELISA試劑盒說明書），酶標儀在450 nm吸光度處測定其OD值。根據(jù)標準曲線的標準方程計算樣品中生長因子濃度，并由此繪制出21天內(nèi)的生長因子累積釋放曲線。

1.5 間充質(zhì)干細胞來源

6周齡SD大鼠乙醚麻醉后脫頸處死，然后在超凈臺下無菌切開后肢皮膚，仔細剔除股骨周圍的肌肉、筋膜等組織，用無菌PBS反復(fù)沖洗骨髓腔并轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中1200轉(zhuǎn)離心4 min，棄上清后加入α-DMEM培養(yǎng)基重新混懸，然后在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)鏡下觀察原代間充質(zhì)干細胞貼壁融合度達到90%以上進行傳代。本研究采用P3代細胞進行后續(xù)實驗。

1.6 體外細胞粘附及增殖試驗

將空白微球和間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單層培養(yǎng)24小時后行吖啶橙染色檢測觀察細胞粘附現(xiàn)象，每皿加入100 μl 0.1%（w/v）的吖啶橙染液，室溫下避光孵育30 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察：綠光代表DNA染色，紅光代表RNA染色，設(shè)定三維體積（X，Y，Z;600 μm;600 μm;60 μm）3D重建出范圍內(nèi)細胞分布和存活情況。于96孔中每個孔接種5×103個BMSCs，空載微球PAGP70或PAGP30按照劑量梯度（0.125、0.25、0.5、1、2毫克/毫升濃度）設(shè)定分組。然后孵育 1、3、5天后將10 μL CCK-8（Dojindo美國）和200 μL新鮮培養(yǎng)基混合后加入，利用波長為450 nm的酶標儀測定吸光度，細胞的存活率與吸光度（OD）呈線性相關(guān)。對結(jié)果進行標準化處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析和處理，數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，多組均數(shù)間的比較采用單向方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微球形貌學(xué)表征及平均粒徑

掃描電鏡對兩種聚磷腈微球進行形貌觀察（圖1）。在獲得的SEM圖像中PAGP70微球外表面光滑并且布滿許多不規(guī)則的孔（圖1A），微球的平均粒徑為54.22±19.19 μm。而PAGP30微球表面粗糙且密集的多孔分布（圖1B），微球的平均粒徑為34.11±18.82 μm。

圖1 兩種聚磷腈微球電鏡照片

2.2 微球體外緩釋特征

繪制生長因子體外緩釋曲線，可觀察到搭載兩種生長因子的微球均有爆發(fā)釋放，PAGP30微球搭載的TGF-β1在第1天內(nèi)有較低的爆發(fā)突釋（48.24%±6.91%），最初的3～5天作為一個平臺期，隨后其藥物釋放逐漸平穩(wěn)并持續(xù)釋放至21天（圖2A）。而搭載IGF-1的PAGP30微球釋放速度明顯較快，第1天內(nèi)累計釋放達59.75%±9.22%，第7天時累計釋放率達97.52%±1.16%（圖2B）。這兩種釋放動力學(xué)的區(qū)別主要是兩種聚磷腈聚合物氨基酸取代比例不同導(dǎo)致兩種微球親疏水性不同。比較這兩種微球最重要的結(jié)果是，兩種微球合并使用時具有不同時間段釋放不同生長因子組合的特點。根據(jù)釋放21天的生長因子總量，計算出微球載藥量，PAGP70（TGF-β1）微球為90.34 ng/mg，PAGP30（IGF-1）微球為569.57 ng/mg。

圖2 聚磷腈微球生長因子緩釋曲線

2.3 細胞粘附及生物相容性檢測

從吖啶橙染色圖像中可以觀察到骨髓間充質(zhì)干細胞在微球表面粘附，呈典型的梭形形態(tài)（圖3）。當采用CCK-8法檢測相對細胞活性時，發(fā)現(xiàn)隨著微球用量增加（0.125～2.0 mg/ml）細胞活性無明顯下降趨勢。5天培養(yǎng)后各組的細胞存活率均在70%以上。這些結(jié)果證明了聚磷腈材料微球表面能夠為細胞粘附提供適宜的環(huán)境，支持細胞保持相應(yīng)表型，并表示2 mg/ml以下為安全濃度。

2.4 生長因子緩釋對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響

通過激光共聚焦吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)釋放生長因子的三個微球組均表現(xiàn)出促進細胞增殖的能力（圖4），通過三維成像技術(shù)進行細胞計數(shù)，發(fā)現(xiàn)空白對照組（未緩釋生長因子）的細胞計數(shù)最少，而搭載生長因子的微球三組細胞數(shù)目均明顯增多，相比于單純TGF-β1或者IGF-1組，兩種緩釋微球組合形成的時空緩釋組細胞增殖能力明顯增加（P＜0.05）（圖5）。說明多種生長因子時間緩釋調(diào)控對骨髓基質(zhì)干細胞的增殖具有更好的促進作用。

圖3 吖啶橙細胞染色檢測聚磷腈微球表面細胞粘附和形態(tài)。生物相容性檢測采用CCK-8法檢測空載聚磷腈微球0.125、0.25、0.5、1、2 mg/ml濃度對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖影響

圖4 激光共聚焦顯微鏡顯示微球緩釋生長因子對間充質(zhì)干細胞增殖的影響

圖5 激光共聚焦顯微鏡3D重建圖下4組之間細胞計數(shù)比較

3 討論

生物制劑釋放系統(tǒng)在一個相對較短的時間跨度中從簡單到復(fù)雜，從單一模式到多功能模式發(fā)展[8]。我們也逐步認識到生長因子在時間的調(diào)控緩釋方式下可以引起更好的治療效果。類似的利用微球不同共聚合物比例和微球直徑尺寸達到多重突發(fā)釋放的方式已經(jīng)在硫酸軟骨素治療骨關(guān)節(jié)炎中應(yīng)用[13]。最近一項研究使用IGF-1和TGF-β3在骨軟骨缺損部位聯(lián)合釋放進行組織修復(fù)，通過改變加載階段的TGF-β3的釋放動力學(xué)變化從而促進骨軟骨缺損區(qū)的修復(fù)[14]。

在臨床治療軟骨損傷中使用的微骨折技術(shù)就是釋放骨髓腔內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞，以此細胞為種子細胞進行缺損區(qū)域的細胞增殖和分化從而促進軟骨愈合[15]。之前的研究已經(jīng)證明軟骨組織在損傷后的急性恢復(fù)期其自身調(diào)控生長因子的表達[7]。其特點也是在初始階段以自分泌或者旁分泌的方式促使TGF-β1和IGF-1表達增加，而后期通過持續(xù)增加TGF-β1的表達維持修復(fù)過程[16，17]，這也是我們實驗設(shè)計中遵循的釋放策略。因此，在體外實驗中模擬軟骨組織自身對損傷區(qū)的自身分泌特點，使用兩種生長因子聯(lián)合時間緩釋策略刺激間充質(zhì)干細胞的生物活性具有重要意義。

本實驗中應(yīng)用的聚磷腈聚合物是一種醫(yī)用合成高分子材料[18]，本研究根據(jù)聚合物合成過程中不同甘氨酸和丙氨酸使用比例，通過掃描電鏡展示出其形貌學(xué)表征。而兩種聚磷腈微球不同的親疏水性特點也在ELISA檢測生長因子釋放過程中決定了藥物釋放動力學(xué)特點，比較這兩種PAGP微球最重要的結(jié)果是最初的爆發(fā)釋放，在最初的5天微球釋放比較中，PAGP30微球高親水性和微球粒徑較小從而快速發(fā)生降解導(dǎo)致更快的釋放，PAGP70微球疏水性氨基酸比例較高導(dǎo)致良好的控制釋放速率。通過材料和細胞共培養(yǎng)試驗觀察到聚磷腈表面的細胞粘附，后續(xù)又通過吖啶橙染色比較不同生長因子緩釋作用對細胞增殖的影響。這種微球釋藥特點可以在局部形成持續(xù)的有效濃度，有助于間充質(zhì)細胞的增殖。當我們將兩種微球同時使用時，形成對緩釋體系的時間調(diào)控。本實驗證明兩種生長因子對細胞增殖均產(chǎn)生促進作用，并且兩種材料聯(lián)合使用的時間緩釋組表現(xiàn)出最好的促進增殖效果，說明持續(xù)釋放中具有生物活性的TGF-β和IGF-I具有協(xié)同效應(yīng)，并對間充質(zhì)干細胞起到持續(xù)的促增殖作用。

4 結(jié)論

應(yīng)用不同氨基酸取代比例設(shè)計的聚磷腈微球具有良好的生物相容性，微球表面利于細胞粘附，其搭載生長因子的緩釋功能在體外實驗中得到初步驗證，尤其時間調(diào)控緩釋在組織工程支架材料改性、構(gòu)建等研究中具有良好前景。