千金藤素通過調(diào)節(jié)eIF4E相關(guān)miR-215促進(jìn)RL-952細(xì)胞凋亡*

李美霞， 張菡菡

(1濱州醫(yī)學(xué)院， 山東 煙臺(tái) 264003； 2高青縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 山東 高青 256300)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，為起源于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，目前在臨床上以手術(shù)治療為主，但晚期和轉(zhuǎn)移患者可選治療措施較少，主要依賴化療，而化療副作用是導(dǎo)致患者治療失敗的主要問題。因此，探尋更為低毒有效的治療藥物是目前子宮內(nèi)膜癌治療的一大需求。

千金藤素(cepharanthine，CEP)提取自傳統(tǒng)中藥千金藤，是一類異喹啉類生物堿[1]，具有調(diào)節(jié)免疫、穩(wěn)定質(zhì)膜、抗炎及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[2]等作用。越來越多的研究顯示，千金藤素在對(duì)抗腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦有著重要作用，千金藤素可以促進(jìn)包括人類白血病細(xì)胞系[3]、膽管癌細(xì)胞[4]和口腔鱗癌細(xì)胞[5]等多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡。

微小RNA(microRNA， miRNA， miR)是一類長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中, 主要參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控[6-7]。 miRNA可以與其靶基因mRNA分子的3’ 端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而引起該mRNA的翻譯抑制或者降解，是一種天然的RNAi 誘導(dǎo)分子[8]。有報(bào)道顯示,用人工miRNA引發(fā)靶向目的基因的RNA干擾(RNA interference,RNAi),比shRNA的抑制效率更高，因此miRNA被作為抑制腫瘤等疾病相關(guān)基因的潛在療法。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果證實(shí)，千金藤素可以通過抑制miR-150和miR-182的表達(dá)而分別上調(diào)p53和FOXO1，從而抑制肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡[9],提示我們千金藤素可以通過影響miRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)下游癌基因和抑癌基因的調(diào)控，miRNA可能是千金藤素在體內(nèi)發(fā)揮抗癌作用的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究了千金藤素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞活力和凋亡的影響，并檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)miR-215的變化，探討千金藤素能否通過調(diào)節(jié)miR-215的表達(dá)來進(jìn)一步影響人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

材 料 和 方 法

1 材料

人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞由大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈(zèng)。miR-215由上海吉瑪公司合成；千金藤素、DMSO和MTT購(gòu)自Sigma；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；miRNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；兔抗人真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF4E)及p-eIF4E單克隆抗體購(gòu)自BioWorld；羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出RL-952細(xì)胞，迅速放入37 ℃溫水中快速搖動(dòng)使其融化，離心后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照每孔5.0×103個(gè)的密度接種于96孔板，24 h后棄去孔中舊培養(yǎng)基，將稀釋好的千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的濃度來處理細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。24 h 后每孔加入100 μL含10% MTT的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO，避光振蕩10 min，酶標(biāo)儀中選取490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，讀取各孔吸光度(A)值。計(jì)算公式如下：細(xì)胞活力抑制率=1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組。

2.3流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照每孔2.0×105個(gè)的密度接種于6孔板，24 h后用千金藤素按照0、10、20、30和40 μmol/L的濃度來處理細(xì)胞，藥物作用24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞后，用無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，離心后收集細(xì)胞沉淀，每管加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，再加入5 μL propidium iodide(PI)混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.4Real-time PCR檢測(cè)最佳有效濃度的千金藤素作用后miR-215的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，24 h后用30 μmol/L千金藤素處理細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞后，應(yīng)用RNAiso for Small RNA 提取細(xì)胞總小RNA，然后進(jìn)行加尾、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA, real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-215的表達(dá)情況，5S rRNA作為反應(yīng)內(nèi)參照。miR-215的上游引物序列為5’-ATGACCTATGATTTGACAG-3’， 5S rRNA的上游引物序列為5’-GCCATACCACCCTGAACG-3’， 通用下游引物序列為5’-AACATGTACAGTCCATGGATG-3’。Real-time PCR為20 μL體系，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。60 ℃至95 ℃繪制熔解曲線。

2.5Western blot 檢測(cè)千金藤素對(duì)eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板，千金藤素(30 μmol/L)加入孔中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入RIPA提取細(xì)胞總蛋白，按照每孔40 μg的上樣量加入濃縮膠孔開始電泳, 電壓80 V，至樣品遷移至濃縮膠與分離膠交界處時(shí)，改為100 V，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，7%封閉液封閉2 h，洗膜后加I 抗4 ℃封閉過夜，洗膜，加II 抗封閉2 h，曝光顯影并拍照。

2.6熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)共分為4組，分別為空白對(duì)照(blank control)組、陰性對(duì)照(negative control，NC)組、pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(GFP-eIF4E-3’UTR)組和pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215共轉(zhuǎn)染(miR-215)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板，除空白對(duì)照組外，后3組用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染1 μg negative control mimics、1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR質(zhì)粒及1 μg miR-215 mimics和1 μg pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR質(zhì)粒，6～8 h后換液，48 h后熒光倒置顯微鏡下觀察各組熒光強(qiáng)度并拍照，拍照結(jié)束后，收集各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組GFP表達(dá)情況。

2.7Western blot檢測(cè)miR-215轉(zhuǎn)染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組和miR-215轉(zhuǎn)染組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RL-952細(xì)胞接種于6孔板，miR-215轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-215 mimics和negative control mimics入細(xì)胞，6～8 h后換液，48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白，行Western blot檢測(cè)，步驟如前。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 千金藤素使RL-952細(xì)胞活力下降

分別采用0、10、20、30和40 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞后，細(xì)胞活力的抑制率均明顯升高(P<0.01)，并呈一定的劑量依賴性，達(dá)到30 μmol/L后再增大藥物濃度，細(xì)胞活力的抑制率不再升高，提示此濃度可作為最佳有效濃度來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

Figure 1. The effect of CEP on the viability of RL-952 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1MTT法檢測(cè)不同濃度千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞活力的影響

2 光鏡檢測(cè)不同濃度的千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞形態(tài)的影響

光鏡下可見，不同濃度的千金藤素處理RL-952細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞皺縮、變圓、脫壁，懸浮死細(xì)胞增多，見圖2。

Figure 2. The morphological changes of RL-952 cells treated with CEP at different concentrations observed under inverted microscrope (×100).

圖2倒置顯微鏡下觀察不同濃度千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞形態(tài)的影響

3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)不同濃度的千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，千金藤素處理細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P<0.01)，可見千金藤素可以誘導(dǎo)RL-952細(xì)胞凋亡，見圖3。

Figure 3. The effect of CEP on the apoptotic rate of RL-952 cells analysis by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度千金藤素對(duì)RL-95細(xì)胞凋亡的影響

4 Real-time PCR檢測(cè)千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞中miR-215表達(dá)的影響

30 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞24 h后，miR-215的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，提示該濃度的千金藤素可有效上調(diào)RL-952細(xì)胞中miR-215的表達(dá)，見圖4。miR-215在子宮內(nèi)膜癌中具有抑癌基因的功能，千金藤素誘導(dǎo)的RL-952細(xì)胞凋亡可能通過升高miR-215的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

5 Western blot檢測(cè)千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞中eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影響

30 μmol/L的千金藤素處理RL-952細(xì)胞48 h后，Western blot結(jié)果顯示藥物處理組eIF4E/GAPDH和p-eIF4E/GAPDH均較對(duì)照組降低(P<0.05或P<0.01),見圖5。

Figure 4. The effect of CEP on the expression of miR-215 in the RL-952 cells detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖4Real-timePCR檢測(cè)千金藤素對(duì)RL-952細(xì)胞miR-215表達(dá)的影響

Figure 5. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖5Westernblot檢測(cè)千金藤素作用后eIF4E及p-eIF4E的表達(dá)結(jié)果

6 miR-215與eIF4E相關(guān)性研究

通過microrna.org(http://www.microrna.org/)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，顯示eIF4E的3’UTR存在miR-215的結(jié)合位點(diǎn),見圖6。

Figure 6. The result of bioinformatic analysis to predict target genes of miR-215 by software searching.

圖6生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)eIF4E為miR-215的靶基因

檢測(cè)GFP表達(dá)以觀察miR-215對(duì)pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR的調(diào)控作用。熒光顯微鏡顯示，pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度較陰性對(duì)照組和單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯減弱，見圖7A；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pcDNA-GFP-eIF4E-3’UTR+miR-215轉(zhuǎn)染組GFP陽(yáng)性率為7.85%，與陰性對(duì)照組和單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(P<0.05)，見圖7B。以上結(jié)果提示eIF4E為miR-215的靶基因，miR-215可有效下調(diào)eIF4E的表達(dá)。

7 miR-215對(duì)RL-952細(xì)胞中eIF4E及p-eIF4E蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-215轉(zhuǎn)染組p-eIF4E表達(dá)顯著降低(P<0.01)，eIF4E表達(dá)亦降低(P<0.05)，見圖8。

討 論

千金藤素具有抗炎、抗多藥耐藥、治療銀屑病和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放化療敏感性等作用，且未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床毒副作用，其在多種腫瘤中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，但尚未見到子宮內(nèi)膜癌中的作用研究報(bào)道。本研究的結(jié)果證實(shí)，千金藤素可抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，這提示千金藤素可以作為臨床子宮內(nèi)膜癌治療的潛在藥物。

本研究嘗試從miRNA角度入手進(jìn)一步研究其機(jī)制。miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演癌基因或者抑癌基因的重要角色。已有報(bào)道顯示，miR-215在結(jié)直腸腫瘤[10]和非小細(xì)胞肺癌[11]等腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用，而在胃癌[12]和宮頸癌[13]等組織中則發(fā)揮著癌基因的作用。關(guān)于miR-215在子宮內(nèi)膜癌中的作用，Karaayvaz等[14]的結(jié)果顯示，miR-215在48例子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和癌旁組織中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Gao等[15]的報(bào)道則顯示miR-215通過下調(diào)LEFTY2促進(jìn)了HEC-1A細(xì)胞的EMT和增殖過程。本研究結(jié)果顯示，有效濃度的千金藤素作用后，miR-215表達(dá)上調(diào)，而生物信息學(xué)軟件分析得到癌基因eIF4E的3’UTR存在miR-215的結(jié)合位點(diǎn)，因此我們推測(cè)千金藤素對(duì)子宮內(nèi)膜癌增殖和凋亡的影響可能是通過影響了miR-215進(jìn)而下調(diào)了eIF4E的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

eIF4E是真核生物翻譯起始復(fù)合物eIF4F復(fù)合體(eIFR3、eIF4A 和eIF4G)的一部分，是真核翻譯起始復(fù)合物最有效的成分之一；另外，eIF4E還調(diào)控著mRNA從細(xì)胞核向核糖體的輸出[16-17],這些都是啟動(dòng)翻譯的關(guān)鍵步驟，因此eIF4E在蛋白質(zhì)翻譯起始階段起著有效的調(diào)控作用，其過表達(dá)或激活所導(dǎo)致的翻譯失調(diào)和多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為一種新型原癌基因，eIF4E在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。2011年Choi等[18]第一次報(bào)道了eIF4E在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，且與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期呈正相關(guān)，應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)eIF4E表達(dá)可有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有效濃度的千金藤素作用于RL-952細(xì)胞后，eIF4E及其活性形式p-eIF4E表達(dá)均有下調(diào)， 提示eIF4E可能是千金藤素下游的靶基因。我們進(jìn)而將人工合成的miR-215作用于RL-952細(xì)胞后，同樣看到了eIF4E及其磷酸化形式p-eIF4E的下調(diào)。結(jié)合上述real-time PCR結(jié)果，我們得到以下結(jié)論，千金藤素可有效抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的活力，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制主要通過上調(diào)miR-215的表達(dá)，進(jìn)而抑制eIF4E及其活性形式p-eIF4E的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。這為千金藤素作為臨床子宮內(nèi)膜癌的輔助治療藥物提供了理論依據(jù)。

Figure 7. The expression of GFP detected by fluorescence microscropy (A) and flow cytometry (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC group.

圖7熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá)

Figure 8. The protein levels of eIF4E and p-eIF4E after miR-215 transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖8Westernblot檢測(cè)miR-215轉(zhuǎn)染后eIF4E及p-eIF4E的蛋白水平