毛蕊花糖苷通過調(diào)控BDNF-TrkB信號(hào)通路改善CUMS大鼠的抑郁樣行為*

鄧海峰， 孫縵利， 吳 瓊， 常全忠

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 河南 漯河 462000)

毛蕊花糖苷(acteoside, Act)是毛蕊花屬植物中的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，毛蕊花糖苷具有滋陰補(bǔ)腎、降血糖、降血脂、抗衰老和抗腫瘤等作用[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷可以通過抗氧化、抗炎和抗凋亡等途徑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有有效的保護(hù)作用[4-5]。抑郁癥也屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，毛蕊花糖苷對(duì)抑郁癥是否有療效，目前還未見研究報(bào)道。本研究旨在通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)的方式建立抑郁癥模型大鼠，探討毛蕊花糖苷對(duì)大鼠抑郁樣行為的影響及可能機(jī)制，以期為臨床上預(yù)防和治療抑郁癥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

108只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，清潔級(jí)，體重200～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK(湘)2011-0003。動(dòng)物自由覓食、飲水，在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)。

2 主要儀器和試劑

Mini-PROTEAN3電泳系統(tǒng)、 Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad；Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自Thermo；FluoView FV1200激光共聚焦顯微鏡購自O(shè)LYMPUS。毛蕊花糖苷購自南京景竹生物科技有限公司；鹽酸氟西汀(fluoxetine, 20 mg)購自美國禮來蘇州制藥有限公司；兔抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B, TrkB)多克隆抗體均購自Abcam；抗β-actin抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)均購自碧云天生物技術(shù)公司；檢測(cè)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)和去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物。

3 主要方法

3.1CUMS模型的建立 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)的方式制備CUMS抑郁癥模型。應(yīng)激包括禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒24 h、45 ℃熱水游泳5 min、4 ℃冰水游泳5 min、懸尾20 min、夾尾2 min、潮濕墊料24 h等8種方式，每天隨機(jī)給予1種應(yīng)激方式，但相鄰2 d給予不同方式應(yīng)激，使應(yīng)激具有不可預(yù)見性，共持續(xù)28 d。

3.2動(dòng)物分組及給藥 成模后將大鼠隨機(jī)分為5組：模型(model)組、鹽酸氟西汀組和毛蕊花糖苷低、中、高劑量(Act-30 mg/kg、Act-60 mg/kg和Act-120 mg/kg)組，每組18只;另取18只正常大鼠作為對(duì)照(control)組。在造模結(jié)束1周后，鹽酸氟西汀組灌胃鹽酸氟西汀(20 mg/kg)，毛蕊花糖苷各劑量組分別灌胃毛蕊花糖苷(30 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg)，對(duì)照組及模型組在相同時(shí)間灌胃等體積的生理鹽水。每天固定時(shí)間給藥1次，連續(xù)3周。末次給藥24 h后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

3.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)裝置為上口徑40 cm、下口徑33 cm的不透明圓形塑料桶，水深30 cm，水溫(24±1) ℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)保持安靜。將大鼠頭部面向桶壁，緩慢放入塑料桶內(nèi)，讓其自由游泳，用秒表記錄大鼠5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間(動(dòng)物四肢不動(dòng)漂浮于水面，僅頭部露出水面呼吸或四肢偶爾劃動(dòng)以保持身體不至于沉下去，即為不動(dòng))。5 min后將大鼠取出并用毛巾擦干后放回鼠籠。

3.4糖水偏好實(shí)驗(yàn) 糖水偏好實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)階段，第一階段為糖水適應(yīng)性訓(xùn)練：一籠一鼠，每個(gè)鼠籠放置2個(gè)裝有200 mL 1%蔗糖溶液的水瓶24 h；第二階段為糖水偏好測(cè)量：適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后立即禁食禁水24 h，之后同時(shí)放置1瓶純水和1瓶1%蔗糖溶液(均為200 mL)，0.5 h后調(diào)換2瓶位置，繼續(xù)放置，0.5 h后測(cè)量并計(jì)算每只大鼠的糖水偏好量,糖水偏好量(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

3.5免疫熒光實(shí)驗(yàn) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取6只大鼠斷頭取腦，經(jīng)心臟灌流，冰凍切片。所得切片經(jīng)破膜、封閉處理后，滴加兔抗BNDF抗體(1∶500)，4 ℃孵育48 h，后加入FITC標(biāo)記的IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，利用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)定積分吸光度(integrated absorbance，IA)。

3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 每組隨機(jī)選取6只大鼠，斷頭取腦，冰上分離海馬組織，剪刀剪碎、稱重，加入裂解液，冰上用玻璃勻漿器勻漿，12 000 r/min低溫離心10 min，吸取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×Laemmil蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)施10% SDS-PAGE，濃縮膠電壓80 V，15 min，分離膠電壓120 V，直至溴酚藍(lán)跑到分離膠底部。轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，TBST洗膜，加入I 抗(TrkB為1∶200，β-actin為1∶200)室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，將膜置于凝膠成像儀中，加入ECL發(fā)光劑，曝光顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白水平。

3.7ELISA實(shí)驗(yàn) 10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取出新鮮腦組織，稱重，加入預(yù)冷的PB緩沖液，冰上用玻璃勻漿器勻漿，12 000 r/min低溫離心15 min，提取上清液，檢測(cè)5-HT、DA和NE的含量。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件與GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 毛蕊花糖苷改善CUMS大鼠抑郁樣行為

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，糖水偏好量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸氟西汀組和毛蕊花糖苷各劑量組大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯縮短，糖水偏好量明顯提高(P<0.05)，見表1。

表1毛蕊花糖苷對(duì)CUMS大鼠抑郁樣行為的影響

Table 1. The effect of acteoside (Act) on depression-like beha-viors in CUMS rats (Mean±SD.n=18)

GroupImmobility time (s)Sugar intake (%)Control71.52±13.4378.64±11.16Model165.75±27.02#40.57±6.39#Fluoxetine95.27±15.36?59.24±7.30?Act-30 mg/kg127.38±20.92?52.73±7.18?Act-60 mg/kg113.64±17.53?57.04±7.92?Act-120 mg/kg92.72±13.17?62.75±9.83?

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

2 毛蕊花糖苷增加CUMS大鼠海馬BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)量

各組大鼠海馬BDNF陽性神經(jīng)元表達(dá)情況見圖1，被標(biāo)記上綠色的為陽性神經(jīng)元。定量分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組海馬BDNF陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸氟西汀組和毛蕊花糖苷各劑量組海馬BDNF陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加(P<0.05)。

3 毛蕊花糖苷提高CUMS大鼠海馬TrkB蛋白表達(dá)水平

各組大鼠海馬的TrkB蛋白表達(dá)情況見圖2,與對(duì)照組相比，模型組大鼠海馬的TrkB蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸氟西汀組和毛蕊花糖苷各劑量組大鼠海馬的TrkB蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。

Figure 1. The observation of BDNF positive neurons in the hippocampus of rats (immunofluorescence staining, ×200). Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖1免疫熒光染色觀察大鼠海馬BDNF陽性神經(jīng)元

4 毛蕊花糖苷提高CUMS大鼠腦內(nèi)5-HT、DA和NE的含量

與對(duì)照組相比，模型組腦組織的5-HT、DA和NE含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸氟西汀組和毛蕊花糖苷各劑量組的5-HT、DA和NE含量明顯增加(P<0.05)，見表2。

Figure 2. The protein expression of TrkB in the hippocampus of rats determined by Western blot. Mean±SD.n=6.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

圖2Westernblot檢測(cè)海馬TrkB蛋白的表達(dá)水平

表2毛蕊花糖苷對(duì)CUMS大鼠腦內(nèi)5-HT、DA和NE含量的影響

Table 2. The effect of acteoside (Act) on 5-HT, DA and NE levels in the brain of CUMS rats (ng/L. Mean±SD.n=6)

Group5-HTDANEControl448.36±24.1764.25±10.91127.46±14.05Model304.52±19.81#48.43±8.32#93.52±12.63#Fluoxetine383.73±21.64?56.28±11.04?112.85±13.17?Act-30 mg/kg357.29±18.47?55.37±9.26?107.37±12.42?Act-60 mg/kg370.58±23.36?56.84±10.45?113.44±14.35?Act-120 mg/kg391.42±22.70?59.66±11.27?116.68±13.71?

#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsmodel group.

討 論

抑郁癥是臨床上常見的一種精神科疾病，主要表現(xiàn)有持續(xù)的心情低落、行動(dòng)遲緩、焦慮和認(rèn)知能力下降等臨床癥狀，具有自殺率高、自殘率高和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給患者家庭帶來了嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。因此，闡明抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及尋找安全、有效的抗抑郁藥已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)界亟待解決的問題。

本研究制備抑郁癥大鼠所采用的CUMS加孤養(yǎng)方式，是目前國際上廣泛使用的抑郁癥模型，已被證實(shí)可以很好地模擬抑郁癥患者的核心癥狀(即快感缺失)和行為方式(如行動(dòng)遲緩、探索能力下降)[7]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，抑郁模型組大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間較正常對(duì)照組明顯縮短，且對(duì)蔗糖的偏好度明顯降低，表明抑郁大鼠模型制備成功。

鹽酸氟西汀是一種5-羥色胺再攝取的選擇性抑制劑，能顯著改善抑郁模型動(dòng)物的抑郁行為，是國內(nèi)外研究抑郁癥的常用陽性對(duì)照藥物[8-9]。本實(shí)驗(yàn)也選用鹽酸氟西汀作為毛蕊花糖苷的陽性對(duì)照藥物。在抑郁模型大鼠制備成功的基礎(chǔ)上，本課題組首先觀察毛蕊花糖苷對(duì)抑郁大鼠行為學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)灌胃給予毛蕊花糖苷后可以明顯改善大鼠的抑郁樣行為，其抗抑郁效果同鹽酸氟西汀。

雖然抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚未闡明清楚，但越來越多的研究表明腦區(qū)BDNF-TrkB信號(hào)通路參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程[10-12]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的重要成員，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤以海馬和皮層的分布最為豐富。BNDF通過與其親和力高的特異性受體TrkB結(jié)合，啟動(dòng)下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)作用，包括促進(jìn)神經(jīng)元的存活、發(fā)育、生長(zhǎng)和分化以及調(diào)節(jié)突觸可塑性和神經(jīng)再生等過程[13]。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過上調(diào)BDNF-TrkB信號(hào)通路增強(qiáng)鹽酸氟西汀的抗抑郁效應(yīng)；Duan等[15]報(bào)道電針治療抑郁癥的機(jī)制是增強(qiáng)中樞BDNF和TrkB的蛋白表達(dá)水平以及mRNA水平；Pandya等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠腦內(nèi)過表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶2可以通過下調(diào)BDNF-TrkB信號(hào)通路產(chǎn)生抑郁效應(yīng),以上研究均表明BDNF-TrkB信號(hào)通路和抑郁癥的發(fā)生有密切關(guān)系。那么毛蕊花糖苷的抗抑郁機(jī)制是否和BDNF-TrkB信號(hào)通路有關(guān)呢？本研究于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，利用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)各組大鼠海馬BDNF和TrkB的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的BDNF和TrkB表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降，而經(jīng)過毛蕊花糖苷治療后，大鼠BDNF和TrkB表達(dá)水平顯著提高，表明毛蕊花糖苷可能通過上調(diào)BDNF-TrkB信號(hào)通路發(fā)揮其抗抑郁效應(yīng)。

1965年有學(xué)者提出抑郁癥發(fā)病機(jī)制的“單胺類遞質(zhì)假說”，得到眾多研究者的證實(shí)支持，該假說認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平或功能下降有關(guān)[17]。中樞內(nèi)的單胺類遞質(zhì)主要有5-HT、DA和NE。有研究認(rèn)為，5-HT可通過5-HT1A受體對(duì)谷氨酸(glutamate，Glu)進(jìn)行調(diào)節(jié)，Glu是腦內(nèi)重要的興奮性遞質(zhì)，當(dāng)慢性應(yīng)激引起5-HT水平下降時(shí)，會(huì)導(dǎo)致突觸后膜上5-HT1A受體功能降低，進(jìn)而使Glu能興奮性突觸過度激活，突觸間的信息傳遞紊亂，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[18]；DA可通過D1受體調(diào)節(jié)Glu及其受體NMDA受體水平，研究表明CUMS誘發(fā)的抑郁大鼠腦內(nèi)DA水平降低，Glu和 NMDA 受體中的NR2B 亞基升高[19]；NE是交感節(jié)后神經(jīng)元末梢釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，其水平降低會(huì)引起交感神經(jīng)興奮性降低，從而出現(xiàn)抑郁癥狀[20]。毛蕊花糖苷的抗抑郁機(jī)制是否與上述單胺類遞質(zhì)水平變化有關(guān)呢？本研究通過ELISA法檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)5-HT、DA和NE的含量并作出統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑郁模型組大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的含量較正常對(duì)照組顯著減少，經(jīng)過毛蕊花糖苷治療后，單胺類遞質(zhì)水平均明顯提高，表明毛蕊花糖苷可能通過提高腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平改善CUMS大鼠的抑郁樣行為。

綜上所述，本研究采用CUMS加孤養(yǎng)方式，制備抑郁大鼠模型并用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而毛蕊花糖苷可以改善CUMS大鼠的抑郁樣行為，具有抗抑郁效應(yīng)，其抗抑郁機(jī)制可能與上調(diào)海馬BDNF-TrkB信號(hào)通路、提高腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)水平有關(guān)，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究明確。