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    氯胺酮對(duì)帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白表達(dá)的影響*

    2018-09-27 12:01:16王丹丹宋俊杰慎曉飛洪道先李會(huì)芳
    中國病理生理雜志 2018年9期
    關(guān)鍵詞:紋狀體黑質(zhì)氯胺酮

    王丹丹, 宋俊杰, 慎曉飛, 洪道先, 韓 峰, 李會(huì)芳, 王 瑩

    (河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科, 河南 開封 475000)

    帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種好發(fā)于中老年人的進(jìn)行性、病因不明的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床癥狀以運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、抑郁及睡眠障礙等為特征,病理顯示腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元減少[1-3],殘存的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)含有不溶性淀粉樣蛋白α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)包涵體[4],在基因突變和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)α-syn的小鼠模型中均觀察到與PD疾病的密切相關(guān)性[5]。在臨床觀察的案例報(bào)告中發(fā)現(xiàn),氯胺酮(ketamine,Ket)對(duì)帕金森病靜止性震顫癥狀具有快速抑制作用[6];也有研究表明,氯胺酮不僅可以改善腦供血,還可以抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減輕應(yīng)激性激素和高代謝反應(yīng)等,通過多種途徑抑制小鼠腦中多巴胺能神經(jīng)元的丟失,提供神經(jīng)保護(hù)作用[7-8];這些作用的產(chǎn)生可能與氯胺酮藥物本身高度的極化性、作用于JNK3通路以及NMDA受體功能有關(guān)[9-11]。但氯胺酮是否對(duì)帕金森病致病特征α-Syn的過表達(dá)及異常聚集產(chǎn)生影響未見報(bào)道。在嚙齒類動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)在給予低劑量(5~20 mg/kg)氯胺酮且分次注射時(shí),產(chǎn)生了劑量依賴性增強(qiáng)的抗抑郁和抗運(yùn)動(dòng)功能障礙作用[12];也有研究表明,給予亞麻醉劑量氯胺酮(8 mg/kg)時(shí),觀察到PD小鼠黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)陽性神經(jīng)元表達(dá)增多、自噬增強(qiáng)、運(yùn)動(dòng)功能改善及神經(jīng)元保護(hù)作用的現(xiàn)象[13]。故本實(shí)驗(yàn)利用低劑量(25 mg/kg)的氯胺酮進(jìn)行研究,旨在初步探討氯胺酮對(duì)小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-Syn表達(dá)的影響,為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病提供相關(guān)理論依據(jù)。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物及分組

    采用SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠48只,鼠齡8~12周,體重 22~32 g,由北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供應(yīng),自由進(jìn)食喂養(yǎng),室溫(23±2)℃,自然光照,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)中小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照(NaCl)組、模型(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)組和治療(MPTP+Ket)組,各組分別給予不同的處理方式。

    2 主要試劑

    鹽酸氯胺酮注射劑(ketamine, Ket)由上海第一制藥廠提供;MPTP購自Sigma,使用生理鹽水配制20 g/L MPTP儲(chǔ)存液及2 g/L MPTP腹腔注射液;鼠抗TH單克隆抗體購自Abcam;鼠抗α-Syn單克隆抗體購自BD;鼠抗β-actin單克隆抗體和羊抗鼠Ⅱ抗購自康為世紀(jì)公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠Ⅱ抗購自Boster。

    3 主要方法

    3.1MPTP-PD小鼠模型制備及動(dòng)物給藥 腹腔內(nèi)注射神經(jīng)毒素MPTP能夠造成小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元和TH表達(dá)減少,并出現(xiàn)類似人類的運(yùn)動(dòng)功能障礙,是制備PD模型的常用方法[14-15]。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)均分為3組。MPTP+Ket組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg),30 min后腹腔注射Ket (25 mg/kg);MPTP組給予腹腔注射MPTP (25 mg/kg),30 min后注射與Ket等體積的生理鹽水;NaCl組在同等時(shí)間給予腹腔注射與MPTP組等體積的生理鹽水。3組小鼠連續(xù)處理7 d。

    3.2Rotarod實(shí)驗(yàn)檢測小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)和平衡能力 將預(yù)訓(xùn)練的小鼠置于轉(zhuǎn)桿上,開始爬行后自動(dòng)記錄轉(zhuǎn)桿滾動(dòng)圈數(shù),至小鼠由轉(zhuǎn)桿掉下來為止。Rotarod實(shí)驗(yàn)采用非連續(xù)性測量法,測定2次,2次相隔時(shí)間1 h。

    3.3Gait analysis system檢測小鼠步態(tài)的變化 將不透明跑道框(10 cm×10cm×50 cm)置于記錄紙上,跑道終點(diǎn)側(cè)2/3處有不透明頂蓋。將小鼠前爪用棉簽涂紅墨水標(biāo)記,后爪涂藍(lán)墨水標(biāo)記后放入跑道內(nèi),對(duì)記錄紙上的后爪足跡進(jìn)行分析。每一次實(shí)驗(yàn)記錄開始后至少連續(xù)3步距離,測量連續(xù)的2個(gè)腳印點(diǎn)間距離及對(duì)側(cè)腳印點(diǎn)到該連線的垂直距離,即分別為步長和步寬。

    3.4腦組織切片的制備 各組小鼠喂養(yǎng)1個(gè)月后,每組隨機(jī)取4只小鼠用于制作腦組織切片:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以戊巴比妥鈉(10 mg/kg)腹腔注射麻醉,依次灌注生理鹽水15 min 和多聚甲醛2 h。灌注完畢后迅速將小鼠置于冰上斷頭取腦,將腦組織置于4%多聚甲醛中,4 ℃固定24 h。使用振蕩切片機(jī)將小鼠腦切至30 μm厚切片,置入0.1 mol/L PBS中-20 ℃保存。

    3.5免疫組化染色檢測小鼠黑質(zhì)內(nèi)TH蛋白表達(dá)的變化 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透,10%山羊血清封閉后,加入鼠THⅠ抗(1∶500)室溫孵育4 h,加入Ⅱ抗(1∶1 000),室溫孵育1 h,DAB染色5~10 min;75%~100%乙醇、乙醇-甲醇混合液(100%乙醇∶甲醇=1∶1)、甲醇梯度脫水,樹脂封片,成片于普通顯微鏡下觀察拍照。

    3.6免疫熒光染色分析α-Syn的表達(dá) 振蕩小鼠腦切片用0.2% Triton通透,10%山羊血清室溫封閉后,加入鼠α-Syn Ⅰ抗(1∶500)室溫孵育4 h,加入Ⅱ抗(1∶1 000),室溫避光孵育1 h,DAPI(1∶1 000)復(fù)染后于熒光顯微鏡下觀察拍照,表達(dá)的α-Syn被熒光Ⅱ抗標(biāo)記為紅色,熒光越強(qiáng)表明α-Syn的表達(dá)越多。

    3.7Western blot 檢測α-Syn蛋白的表達(dá) 冠狀切出包含黑質(zhì)及紋狀體的腦組織,然后進(jìn)行勻漿裂解、離心,取上清,于-80 ℃保存,備用腦組織用于蛋白提取。SDS-PAGE分離提取的蛋白,每泳道總蛋白量200 μg。電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉液封閉1.5 h。α-Syn Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,X線膠片曝光,顯影、定影。為了證實(shí)每個(gè)泳道總蛋白量相等,用剝脫液洗膜后,封閉液封閉1.5 h,以β-actin Ⅰ抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜,HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶4 000)室溫下孵育1 h,X線膠片曝光,顯影、定影。用天能化學(xué)發(fā)光掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描。運(yùn)用Quantity One系統(tǒng)軟件分析條帶吸光度。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 低劑量氯胺酮改善PD小鼠行為運(yùn)動(dòng)特征

    與NaCl組比較,小鼠腹腔注射MPTP后,出現(xiàn)了明顯的姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩的癥狀,行為學(xué)測試結(jié)果顯示轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)減少,步距減小(P<0.05);與MPTP組比較,用低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠姿勢(shì)步態(tài)不穩(wěn)、步距減少的癥狀得到明顯改善(P<0.05)。Rotarod實(shí)驗(yàn)與gait analysis system結(jié)果相符,MPTP+Ket組的數(shù)據(jù)均明顯優(yōu)于MPTP組,見表1。

    表1Rotarod轉(zhuǎn)棒儀圈數(shù)與gaitanalysissystem步距結(jié)果

    Table 1. The results of rotarod experiment and gait analysis system (Mean±SD.n=9)

    GroupRotarod cycle Step length (cm)NaCl74.13±1.277.11±0.11MPTP45.46±1.11#6.75±0.05#MPTP+Ket66.77±1.93?7.09±0.08?

    #P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    2 低劑量氯胺酮具有神經(jīng)保護(hù)作用

    MPTP腹腔注射造成小鼠的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失。統(tǒng)計(jì)分析顯示,與NaCl組相比,MPTP組多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.05);用低劑量氯胺酮處理后,MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元增加,統(tǒng)計(jì)分析顯示,與MPTP組相比,MPTP+Ket組的多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05),見圖1。

    Figure 1. The changes of dopaminergic neurons in the substantia nigra (×10). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖1小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目差異的比較

    3 低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的異常表達(dá)

    3.1低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光強(qiáng)度較NaCl組明顯增強(qiáng)(P<0.05),這表示MPTP組的α-Syn異常表達(dá)增多,與臨床病理結(jié)果相符;用低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)免疫熒光強(qiáng)度較MPTP組明顯減弱(P<0.05),見圖2、3。

    3.2低劑量氯胺酮抑制小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn蛋白表達(dá) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NaCl組比較,經(jīng)MPTP腹腔注射的小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)量明顯增加(P<0.05);低劑量氯胺酮處理后,PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)量減少(P<0.05),支持免疫組化的結(jié)果,見圖4。

    討 論

    隨著我國逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì),PD患者將會(huì)急劇增長并長期維持在較高水平[16-17]。帕金森病患者生理指標(biāo)有多種改變[18],但其病理特征表現(xiàn)為在殘存的神經(jīng)元胞體內(nèi)出現(xiàn)以α-Syn的包涵體和神經(jīng)突起[19]。目前認(rèn)為,α-Syn是 PD發(fā)病機(jī)制中一種重要的蛋白,在α-Syn突變、過度表達(dá)的野生型及氧化應(yīng)激等多種因素作用下,其異常聚集形成路易小體,并進(jìn)一步損害多巴胺神經(jīng)元[5, 20-21],與PD的發(fā)病密切相關(guān)。因此,治療PD時(shí),針對(duì)α-Syn異常聚集的干預(yù)顯得尤為重要。氯胺酮常作為全身麻醉藥物應(yīng)用于臨床,近年來臨床病例觀察和病例系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)[6, 22-23],在應(yīng)用氯胺酮對(duì)帕金森病患者進(jìn)行麻醉時(shí),可產(chǎn)生快速抑制帕金森病靜止性振顫的作用;體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也觀察到氯胺酮在多種帕金森病模型中均能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,這種作用可能與改變大腦電活動(dòng)、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、NMDA受體及多種信號(hào)通路有關(guān)[12, 24-26]。但有關(guān)氯胺酮對(duì)帕金森病典型致病標(biāo)志α-Syn蛋白是否有影響卻鮮有報(bào)道,本論文目的為利用MPTP小鼠模型研究氯胺酮對(duì)PD小鼠α-Syn的影響,為了解氯胺酮治療帕金森病的可能性,指導(dǎo)臨床用藥。

    Figure 2. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the substantia nigra (×10). SNc: substantia nigra, compact part; SNr: substantia nigra, reticular part. Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖2低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

    Figure 3. The effect of low-dose ketamine (Ket) on the expression and abnormal accumulation of α-Syn (red) in the caudate putamen (CPu, ×4). Mean±SD.n=4.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖3低劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠紋狀體區(qū)α-Syn表達(dá)的影響

    Figure 4. The results of Western blot. A: the protein expression of α-Syn in the substantia nigra; B: the protein expression of α-Syn in the CPu. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsNaCl group;*P<0.05vsMPTP group.

    圖4Westernblot檢測黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn的表達(dá)

    PD模型有MPTP腹腔注射、6-OHDA和MPP+靶向注射等多種模型制備方式[15, 27-28],神經(jīng)毒素 MPTP 腹腔注射 C57BL/6 小鼠被認(rèn)為是較操作簡單、制模理想的方法之一。本研究結(jié)果顯示,MPTP組與 NaCl組行為學(xué)、免疫組化TH染色、α-Syn蛋白免疫熒光染色及Western blot的結(jié)果均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,與前期文獻(xiàn)[29-31]研究結(jié)果一致,說明本實(shí)驗(yàn)用 MPTP 誘發(fā) C57BL/6 小鼠的PD復(fù)制方法簡單有效。在本實(shí)驗(yàn)中,連續(xù)給予低劑量氯胺酮腹腔注射后,MPTP+Ket組與MPTP組小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間明顯延長,小鼠步距明顯增大,表明小劑量氯胺酮對(duì)PD小鼠動(dòng)作的協(xié)調(diào)性、姿勢(shì)不穩(wěn)及步距減小的行為學(xué)癥狀得到明顯改善。免疫組化TH染色結(jié)果顯示,經(jīng)低劑量氯胺酮處理后MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯增多,這說明低劑量氯胺酮減輕了MPTP導(dǎo)致的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。免疫熒光及Western blot檢測均提示MPTP可以誘導(dǎo)小鼠黑質(zhì)、紋狀體區(qū)的α-Syn表達(dá)增多,證實(shí)了α-Syn的異常表達(dá)可以產(chǎn)生帕金森病癥狀;但經(jīng)低劑量氯胺酮處理后,MPTP+Ket組小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)熒光明顯減弱,表明α-Syn表達(dá)量減少,與此相應(yīng)PD小鼠的行為學(xué)癥狀改善相符合,表明低劑量氯胺酮干預(yù)可能是通過抑制α-Syn蛋白的過表達(dá)而改善帕金森病癥狀的,說明針對(duì)α-Syn的干預(yù)是有效的,但氯胺酮抑制α-Syn的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究重新探索了現(xiàn)已成熟應(yīng)用的臨床藥物氯胺酮在麻醉以外的治療應(yīng)用,從帕金森病的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制——α-Syn異常聚集并損傷多巴胺神經(jīng)元——出發(fā),發(fā)現(xiàn)氯胺酮對(duì)PD小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-Syn異常表達(dá)具有抑制作用,并認(rèn)為通過改變?chǔ)?Syn的表達(dá)可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用氯胺酮治療帕金森病在一定程度上提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

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