胚鼠腭裂形成過程中腭胚組織全基因組DNA甲基化的研究*

劉 丹， 舒申友， 李 珂， 舒 璇， 董澤君， 郎 興

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院燒傷整形外科， 廣東 汕頭 515041)

非綜合征型單純性腭裂(nonsyndromic cleft pa-late only，NSCPO)是一種先天性缺陷病，嚴(yán)重影響人們的健康及生活質(zhì)量。目前NSCPO的發(fā)病機(jī)制尚不清晰，已證實(shí)基因突變和環(huán)境影響都是NSCPO的復(fù)雜病因[1-2]。大量研究表明DNA甲基化對(duì)維持細(xì)胞正常功能、胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生有重要作用，因作用位點(diǎn)較廣且調(diào)控結(jié)果可逆、可遺傳等特性而受到關(guān)注。Rogers等[3]的研究表明，對(duì)妊娠第10天(gestational day 10, GD10)的雌性孕鼠給予高劑量的DNA去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷時(shí)，胚鼠腭裂的頻率變高。Bulut等[4]注意到，在GD11和GD14向小鼠施用5-氮雜胞苷(5-氮雜-2’-脫氧胞苷的核苷類似物)時(shí)出現(xiàn)多種先天性發(fā)育畸形，其中就包括腭裂，提示該化合物的去甲基化作用對(duì)早期胚胎發(fā)育具有易感性。因此本研究使用高效低成本全基因組DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)——甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶測(cè)序(methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,MethylRAD-Seq)法對(duì)不同時(shí)段的腭裂模型組和正常對(duì)照組小鼠腭胚組織進(jìn)行全基因組DNA甲基化測(cè)序，比較基因組不同元件中甲基化位點(diǎn)的差異分布及甲基化水平的差異基因，對(duì)甲基化位點(diǎn)的位置信息進(jìn)行注釋，并對(duì)差異甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因和甲基化差異基因進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，篩選與胚鼠腭裂形成相關(guān)基因及信號(hào)通路，為進(jìn)一步闡明NSCPO的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/J小鼠動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(京)2012-0001(北京維通利華公司)，飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，8～10 周齡，體重22～28 g，飼養(yǎng)溫度(25±2) ℃，人工調(diào)控晝夜循環(huán)，自由進(jìn)飲進(jìn)食。

2 主要試劑

全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)(Sigma)；玉米油(中糧集團(tuán))。

3 主要方法

3.1構(gòu)建維甲酸誘導(dǎo)的胚鼠腭裂模型 將70 mg ATRA溶于10 mL 玉米油中,配制濃度為7 g/L的ATRA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)當(dāng)天中午12:00以2∶1雌雄合籠，次日晨8:00將雌雄鼠分籠飼養(yǎng)，雌鼠均視為疑似受孕，記為GD0.5。雌鼠隨機(jī)編號(hào)，稱體重并記錄。在GD10.5 晨 8:00 時(shí)依次稱量雌鼠體重，觀察腹部明顯膨隆且體重增加大于2.5 g者視為實(shí)驗(yàn)孕鼠，其余視為假孕并繼續(xù)以同法合籠交配，共得到的實(shí)驗(yàn)孕鼠18只，隨機(jī)分3組(A、 B和C組)，每組6只；每組再分成2小組，每小組3只，比如A組包括A1、A2、A3、a1、a2和a3，其中A為模型組，a為對(duì)照組。所有模型組(A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2和C3)在GD10.5分別給予管飼ATRA (70 mg/kg)，對(duì)照組(a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2和c3)在GD10.5給予管飼玉米油(0.20 mL/kg)。

3.2樣本的獲取及保存 分別于GD13.5、14.5和16.5使用脫頸法處死模型組及對(duì)照組小鼠,無(wú)菌操作，在顯微鏡下解剖摘取胚鼠口腔內(nèi)的腭突組織，新鮮腭突組織標(biāo)本取下立即放入無(wú)菌凍存管并置于液氮凍存(來(lái)自同1個(gè)孕鼠的所有腭突組織作為1例樣本)。

3.3全基因組DNA甲基化測(cè)序 采用QIAamp DNA Mini Kit 法提取組織樣本DNA,并采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA純度，18個(gè)樣本委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行全基因組DNA甲基化檢測(cè)。MethylRAD-Seq法是利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶(FspE I)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，F(xiàn)spE I可以識(shí)別DNA上甲基化位點(diǎn)，把FspE I的識(shí)別位點(diǎn)標(biāo)識(shí)為CCGG和CCWGG，其中簡(jiǎn)并堿基W代表堿基A和T，在識(shí)別位置的下游隔一定位置進(jìn)行酶切，如果DNA 2條鏈的甲基化狀態(tài)是對(duì)稱的，那么就可以切割產(chǎn)生一個(gè)固定長(zhǎng)度的片段(32 bp)，這些片段給予合適的接頭序列(adaptor)連接后進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建成帶有樣本特異性條紋碼序列(barcode sequence)的文庫(kù)。18個(gè)樣品的標(biāo)簽序列文庫(kù)在Hiseq X Ten平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到原始測(cè)序序列(Raw Data)。原始測(cè)序序列經(jīng)過濾刪除含有接頭序列的Reads及低質(zhì)量Reads，使用Pear 0.9.6軟件拼接后，最后過濾刪除含有N堿基的序列得到Clean Data。參考基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-84/fasta/mus_musculus/dna/Mus_musculus.GRCm38.dna.toplevel.fa.gz)，從C57BL/J小鼠基因組序列中提取所有的CCGG和CCWGG位點(diǎn)，建立標(biāo)簽對(duì)比的參考序列。最后利用SOAP 2.21軟件將這些高質(zhì)量的MethylRAD測(cè)序標(biāo)簽比對(duì)到構(gòu)建的CmCGG和CmCWGG位點(diǎn)的參考序列上(參數(shù)設(shè)置為：-M4-v 2-r0)唯一位置的序列，進(jìn)行全基因組DNA甲基化水平的檢測(cè)，將測(cè)序深度不低于3的位點(diǎn)判定為可靠的甲基化位點(diǎn)。最后將測(cè)得的3個(gè)時(shí)段有差異甲基化位點(diǎn)所在的基因及甲基化差異基因都導(dǎo)入DAVID基因功能分析平臺(tái)進(jìn)行GO和 KEGG通路分析，對(duì)基因的功能及信號(hào)通路進(jìn)行注釋。

結(jié) 果

1 甲基化位點(diǎn)的數(shù)量及甲基化水平的比較

根據(jù)等長(zhǎng)標(biāo)簽擴(kuò)增效率的一致性，甲基化標(biāo)簽的測(cè)序深度可以反映位點(diǎn)的甲基化水平。以測(cè)序深度不低于3的位點(diǎn)判定為可靠的甲基化位點(diǎn)，考慮到參考序列中存在重復(fù)區(qū)，位于重復(fù)區(qū)的Reads能夠同時(shí)比對(duì)到參考序列的多個(gè)位置，對(duì)于這種甲基化位點(diǎn)的實(shí)際發(fā)生位置難以進(jìn)行判斷，鑒于此，在進(jìn)行比對(duì)時(shí)，不考慮重復(fù)比對(duì)的Reads，18個(gè)文庫(kù)的Enzyme Reads (Clean Reads 質(zhì)控后含有預(yù)期酶切位點(diǎn)的Reads)能比對(duì)到參考序列唯一位置的比對(duì)率見表1。根據(jù)這18個(gè)樣本的全基因組DNA甲基化的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析了每個(gè)樣本的甲基化位點(diǎn)數(shù)量及平均測(cè)序深度，見表2。

表118個(gè)文庫(kù)的EnzymeReads比對(duì)到參考序列唯一位置的比對(duì)率

Table 1. The ratio of Enzyme Reads matching the alignment to the only position in the reference sequence

SampleClean ReadsEnzyme ReadsMapping ReadsRatioA1142,855,38380,720,50857,927,32571.76%A2142,855,38379,838,18659,697,33474.77%A3142,855,38378,129,09256,390,99572.18%B1131,029,92052,959,69138,391,98672.49%B2131,029,92056,224,18141,472,60573.76%B3131,029,92054,365,63438,595,47370.99%C1154,938,89169,209,73550,154,76972.47%C2116,896,71535,423,26724,085,45567.99%C3116,896,71544,807,99532,803,91173.21%a1116,896,71546,276,55434,624,76874.82%a2116,896,71542,914,10430,874,53171.94%a3142,855,38371,659,10652,037,53372.62%b1142,120,40259,873,38744,498,70374.32%b2142,120,40258,784,35842,436,66072.19%b3131,029,92042,987,51629,595,82668.85%c1154,938,89155,011,78437,939,28368.97%c2154,938,89168,822,66149,747,69972.28%c3154,938,89171,858,94053,483,39974.43%

表218個(gè)樣本甲基化位點(diǎn)平均測(cè)序深度

Table 2. The average sequencing depth of the methylation sites (CCGG and CCWGG) in 18 samples

SampleCCGG siteCCWGG siteSite numberMean depthSite numberMean depthA1812,06953.0991,6529.94A2869,98048.55105,9989.22A3837,89049.05108,1589.29B1752,15038.6057,5459.07B2815,02237.1250,8988.33B3770,02637.6555,4698.32C1818,90944.9369,6508.85C2742,80924.7449,2277.99C3736,46332.9953,1678.17a1784,09130.0750,5777.63a2761,07230.0856,4357.87a3850,65746.9394,7848.56b1823,50838.2978,5788.15b2790,14240.3269,1228.65b3767,88829.1657,2528.36c1828,04334.9165,3609.07c2800,21747.1763,6529.68c3860,56345.3474,8778.33

2 甲基化位點(diǎn)在基因元件的分布情況

使用SnpEff 4.3p軟件，根據(jù)注釋文件計(jì)算獲得非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)，使用bedtools 2.25.0軟件統(tǒng)計(jì)了18個(gè)樣本的甲基化位點(diǎn)在3’-UTR、5’-UTR、TSS2000(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp內(nèi)的區(qū)域)、intron(內(nèi)含子區(qū))、exon(外顯子區(qū))和intergenic region (基因間區(qū))6個(gè)基因功能元件的甲基化位點(diǎn)數(shù)、分布特點(diǎn)及差異，甲基化位點(diǎn)數(shù)量在exon、intron和intergenic region這3個(gè)基因元件上的數(shù)量明顯多于3’-UTR、5’-UTR和TSS2000這3個(gè)元件，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The distribution and quantitative statistics of 18 samples of DNA methylation sites in 6 gene functional elements. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖118個(gè)樣本DNA甲基化位點(diǎn)在6個(gè)基因功能元件的分布及數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3 差異甲基化位點(diǎn)在基因及染色體上的分布特點(diǎn)

以實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)分3組進(jìn)行比較，使用edgeR軟件計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)在組間的差異P值及差異倍數(shù)log2FC并判斷甲基化水平變化趨勢(shì)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)后，將P<0.05且log2FC絕對(duì)值大于1的位點(diǎn)判定為差異甲基化位點(diǎn)。3個(gè)時(shí)點(diǎn)組的差異甲基化位點(diǎn)數(shù)量見表3，在不同基因功能元件上所占的比例見表4。從上述2個(gè)表中可見3個(gè)時(shí)點(diǎn)的差異甲基化位點(diǎn)都主要集中在內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)和外顯子區(qū)，組間比較無(wú)顯著差異。有差異的甲基化位點(diǎn)主要集中在CCGG位點(diǎn)上；從時(shí)間上比較，隨著時(shí)間推移，上調(diào)的差異甲基化位點(diǎn)數(shù)量明顯減少，下調(diào)的差異位點(diǎn)數(shù)量逐漸增加。差異甲基化位點(diǎn)在染色體上的分布可能是不均勻的，在基因組不同功能元件的差異甲基化位點(diǎn)分布表明，CCGG/CCWGG主要位于內(nèi)含子和基因間區(qū)域，見圖2。

表33個(gè)時(shí)點(diǎn)差異甲基化位點(diǎn)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

Table 3. The numbers of differential methylation sites at the 3 time points

GroupUp-regulated site numberDown-regulated site numberCCGG siteCCWGG siteCCGG siteCCWGG siteGD13.510 9571 6182 910864GD14.58 3431 0698 9551 294GD16.58817099 302871

表4 3個(gè)時(shí)點(diǎn)差異甲基化位點(diǎn)在基因功能元件上所占的比例

Figure 2. The distribution of differential methylation sites on chromosomes. A, C and E: CCGG methylation sites; B, D and F: CCWGG methylation sites. A and B: GD13.5; C and D: GD14.5; E and F: GD16.5. The methylation level up-regulation and down-regulation sites are expressed in brown and blue, respectively.

圖2差異甲基化位點(diǎn)在染色體上的分布圖

4 差異甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因的GO和KEGG富集分析

對(duì)差異甲基化位點(diǎn)所在的基因進(jìn)行GO功能富集分析，對(duì)基因的功能進(jìn)行描述(結(jié)合GO注釋結(jié)果)，GO分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義從而挑選用于后續(xù)研究的基因。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異位點(diǎn)所在基因進(jìn)行通路分析(結(jié)合KEGG注釋結(jié)果)，通路分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有提示的作用，通過差異位點(diǎn)的基因進(jìn)行通路分析，可以找到差異位點(diǎn)的基因可能與哪些細(xì)胞通路的改變有關(guān)。我們統(tǒng)計(jì)并繪制了差異甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因的GO功能富集前30項(xiàng)及KEGG通路前20項(xiàng)的富集圖，見圖3、4。

Figure 3. Differential methylation site-related genes analyzed by GO function enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖3差異甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因的GO功能富集結(jié)果

5 甲基化差異基因的GO和KEGG富集分析

計(jì)算基因內(nèi)的所有位點(diǎn)測(cè)序深度總和，代表其基因的甲基化水平，而后進(jìn)行組間比較,分組同前。對(duì)模型組和對(duì)照組樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的基因，要求至少存在一個(gè)組，組內(nèi)所有樣品在基因的測(cè)序深度均高于3，對(duì)P<0.05且log2FC絕對(duì)值大于1的位點(diǎn)判定為差異基因。我們匯總了這些甲基化水平有差異的基因，統(tǒng)計(jì)了這些基因甲基化水平上、下調(diào)的信息，繪制了差異甲基化基因的數(shù)量統(tǒng)計(jì)表，見表5。最后將這些甲基化差異基因進(jìn)行GO功能富集和 KEGG信號(hào)通路富集分析，為尋找腭裂相關(guān)基因及通路提供數(shù)據(jù)依據(jù)。我們統(tǒng)計(jì)并繪制了甲基化差異基因GO功能富集的前30項(xiàng)及KEGG通路前20項(xiàng)的富集圖,見圖5、6。

6 腭裂形成相關(guān)的基因及信號(hào)通路

目前普遍認(rèn)為ATRA導(dǎo)致小鼠腭裂的發(fā)生機(jī)制主要有以下3點(diǎn)：(1)內(nèi)側(cè)邊緣上皮細(xì)胞的周皮細(xì)胞發(fā)生凋亡所致；(2)原舌肌及下頜骨在發(fā)育過程中相應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡所致；(3)抑制間充質(zhì)細(xì)胞的增殖所致。參照上述病因機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選取了數(shù)個(gè)明顯GO富集結(jié)果和KEGG通路分析結(jié)果,并在其中挑取了6個(gè)有明顯差異的基因(Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53)，以及MAPK、Wnt和TGF-β信號(hào)通路作為下一步驗(yàn)證對(duì)象,見表6。

Figure 4. Differential methylation site-related genes analyzed by KEGG pathway enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖4差異甲基化位點(diǎn)相關(guān)基因的KEGG通路富集結(jié)果

表5 3個(gè)時(shí)點(diǎn)差異甲基化基因的數(shù)量統(tǒng)計(jì)

Figure 5. Methylation differential genes analyzed by GO function enrichment. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖5甲基化差異基因的GO富集結(jié)果

討 論

表觀遺傳學(xué)與腭裂形成的相關(guān)性的研究最近幾年才開始引起關(guān)注，表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、microRNA、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑及非編碼 RNA調(diào)控等。目前研究腭裂發(fā)生機(jī)制主要集中在基因突變和環(huán)境變化。遺傳改變被認(rèn)為可導(dǎo)致20%～25%的腭裂病例[5-6]，而解釋遺傳改變的一種機(jī)制是在胚胎發(fā)育過程中易感基因的異常甲基化，導(dǎo)致正常腭發(fā)育所必需的關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)生改變，故查找腭裂疾病相關(guān)基因及探究其致病機(jī)制尤為迫切。

本實(shí)驗(yàn)我們選用ATRA誘導(dǎo)的小鼠腭裂模型和MethylRAD-Seq技術(shù)。在腭裂疾病的基因研究中，常用到ATRA、地塞米松和TCDD(四氯二苯并-p-二噁英)等藥物誘導(dǎo)先天性小鼠腭裂模型。本實(shí)驗(yàn)我們選用ATRA誘導(dǎo)C57BL小鼠，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明此模型穩(wěn)定可靠[7]。MethylRAD-Seq技術(shù)是一種新開發(fā)的高效低成本的全基因組的DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)[8]，可以對(duì)全基因組內(nèi)的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定量和定性分析，其原理主要是利用甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶(FspE I和MspJ I)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，基因組中CmCGG和CmCWGG位點(diǎn)上的甲基化修飾均可以被識(shí)別，酶切后產(chǎn)生具有核心甲基化位點(diǎn)的等長(zhǎng)標(biāo)簽，對(duì)標(biāo)簽文庫(kù)再進(jìn)行高通量測(cè)序，最終獲得全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)序列信息。根據(jù)等長(zhǎng)標(biāo)簽擴(kuò)增效率的一致性，甲基化標(biāo)簽的測(cè)序深度可以反映位點(diǎn)(CmCGG/CmCWGG)的甲基化水平。已有研究利用基因組背景清晰的模式生物擬南芥，對(duì)MethylRAD-Seq技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[9]。結(jié)果表明，MethylRAD-Seq具有很好的技術(shù)重復(fù)性，假陽(yáng)性率在0.5%以內(nèi)，可以檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)胞嘧啶的甲基化水平，并且該方法可以評(píng)估基因組染色體區(qū)域的甲基化水平分布。該技術(shù)結(jié)合了甲基修飾依賴性內(nèi)切酶和簡(jiǎn)化基因組限制性酶切分型技術(shù)的特點(diǎn)，在不需要基因組背景信息的前提下可以大規(guī)模挖掘全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)，直接獲得甲基化胞嘧啶的序列信息；既可以用于未知甲基化位點(diǎn)的開發(fā)，也可用于不同樣本間的甲基化位點(diǎn)的差異研究。

Figure 6. Methylation differential gene by KEGG pathway enrichment results. A: CCGG methylation sites; B: CCWGG methylation sites.

圖6甲基化差異基因的KEGG富集結(jié)果

表6 Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53基因注釋信息

FC: fold change; Chr: chromosome.

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)了樣本的DNA差異甲基化位點(diǎn)主要分布在內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)和外顯子區(qū)。內(nèi)含子區(qū)域的差異甲基化位點(diǎn)占到了約39%，這可能是由于內(nèi)含子對(duì)翻譯轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無(wú)結(jié)構(gòu)意義，不受自然選擇的壓力，累積更多突變有關(guān)。與甲基化使基因表達(dá)降低的啟動(dòng)子區(qū)相反，基因間區(qū)的甲基化水平傾向于與轉(zhuǎn)錄正相關(guān)[10]，基因間區(qū)的甲基化與轉(zhuǎn)錄的激活機(jī)制密切相關(guān)[11]。本次測(cè)序數(shù)據(jù)提示基因間區(qū)的差異甲基化位點(diǎn)占到了約40%。但DNA甲基化在基因間區(qū)內(nèi)的具體作用尚不清楚，組織特異性基因的基因間區(qū)中發(fā)生異常甲基化，是否可能減少轉(zhuǎn)錄或增加轉(zhuǎn)錄延伸；基因間區(qū)的甲基化修飾在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能上是否可部分替代啟動(dòng)子的作用值得我們進(jìn)一步探究。通過對(duì)3組18個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)基因不同功能元件的甲基化位點(diǎn)的峰值個(gè)數(shù)和峰值在對(duì)照組無(wú)明顯變化，實(shí)驗(yàn)組甲基化整體水平隨著時(shí)間推移逐漸降低；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的CmCGG型甲基化位點(diǎn)都明顯多于CmCWGG型，而且CmCGG型的甲基化位點(diǎn)的甲基化測(cè)序深度明顯高于CmCWGG型，推斷基因組內(nèi)DNA發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，仍主要集中在CpG-二核苷酸上。甲基化差異基因的分析證實(shí)了intron、exon和intergenic region這3個(gè)功能元件上甲基化差異基因數(shù)量明顯多于3’-UTR、5’-UTR和TSS2000，我們推測(cè)相關(guān)基因的異常甲基化可能是腭裂發(fā)生的重要原因。

關(guān)于腭裂與DNA甲基化的研究，相關(guān)甲基化差異基因篩選和驗(yàn)證以及相關(guān)通路的調(diào)控機(jī)制將是非常重要的步驟。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)3組18個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)3個(gè)組共計(jì)1 497個(gè)有差異甲基化表達(dá)的基因(P<0.05)，并進(jìn)行GO功能富集和 KEGG通路富集分析，結(jié)合胚鼠腭裂病理生理發(fā)生機(jī)制，篩選了腭裂形成相關(guān)的6個(gè)基因(Fgf16、Jarid2、Kdm6a、Nr3c1、Tbx22和Trp53)；這些基因的差異甲基化位點(diǎn)主要位于exon、TSS2000、intron和intergenic region；結(jié)合這些基因?qū)?yīng)的GO注釋，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fgf16與GO:0005104(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的分子功能)和GO:0008543(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路)密切相關(guān)；Jarid2與GO:0031061(組蛋白甲基化的負(fù)調(diào)控)、GO:0048863(干細(xì)胞分化)、GO:0042127(細(xì)胞增殖的調(diào)控)和GO:0016568(染色質(zhì)修飾)密切相關(guān)；Tbx22與GO:0005634(細(xì)胞核)、GO:0045892(以DNA為模板轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控)、GO:0000122(RNA聚合酶II對(duì)轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控)、GO:0003700(DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性)、GO:0006351(以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄)和GO:0003677(DNA結(jié)合的分子功能)密切相關(guān)；Kdm6a與GO:0035097(組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體)、GO:0071557(組蛋白H3-K27去甲基化)、GO:0060070(經(jīng)典Wnt信號(hào)通路)、GO:0001701(子宮內(nèi)胚胎發(fā)育)和GO:0048333(中胚層細(xì)胞分化)密切相關(guān)；Nr3c1與GO:0031946(糖皮質(zhì)激素生物合成過程的調(diào)控)、GO:0016020(細(xì)胞膜)、GO:0005737(細(xì)胞質(zhì))、GO:0006355(以DNA為模板轉(zhuǎn)錄的調(diào)控)和GO:0016568(染色質(zhì)修飾)密切相關(guān)；Trp53與GO:0097371(MDM2/MDM4家族蛋白結(jié)合的分子功能)、GO:0034103(組織重塑的調(diào)控)、GO:0090343(細(xì)胞衰老的正調(diào)控)、GO:0035033(組蛋白脫乙酰酶的調(diào)控活性)、GO:0048568(胚胎器官發(fā)育)、GO:0009792(出生或卵孵化時(shí)胚胎發(fā)育終止)、GO:2000269(成纖維細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控)、GO:0035264(多細(xì)胞生物生長(zhǎng)過程)和GO:0042981(凋亡過程的調(diào)控)密切相關(guān)。與腭裂形成相關(guān)的通路主要有MAPK、Wnt、TGF-β等信號(hào)通路，這些差異位點(diǎn)的功能富集主要集中在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝等，推測(cè)小鼠腭裂的產(chǎn)生有表觀遺傳學(xué)的參與及調(diào)控。而這些通路與前人的研究有許多共通之處，一方面驗(yàn)證了前人的研究，另一方面也為探究腭裂疾病與相關(guān)基因突變研究提供新的思路。很多實(shí)驗(yàn)已證明腭間充質(zhì)細(xì)胞合成的蛋白多糖是腭支架升高的必要條件[12-14]。圍繞這一動(dòng)態(tài)發(fā)育過程，后續(xù)我們可以從糖蛋白信號(hào)通路富集的基因中篩選出與腭裂形成的相關(guān)基因，進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證。NSCPO的病因是復(fù)雜的，涉及遺傳和環(huán)境因素，推測(cè)、鑒定基因和研究相關(guān)信號(hào)通路將是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。