H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

莫?jiǎng)偬m 甘海霞 粟艷瓊 梁媛 張步嫻 屈素潔 尹彥文 施開(kāi)創(chuàng) 李軍 鄒聯(lián)斌

(廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧 530001)

禽流感是由 A 型流感病毒(AIV)引起的一種禽類(lèi)病毒性疾病，主要侵害雞、火雞、鴨、鵝等，是目前世界上威脅養(yǎng)禽業(yè)最重要疫病之一。根據(jù) AIV 血凝素 ( HA) 和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，甲型流感病毒可以分為 18 個(gè) HA 亞型和 9 個(gè) NA 亞型[1～4]。1965年，H6 亞型禽流感病毒第一次從火雞身上分離到，2003 年Wang等[5]試驗(yàn)表明，對(duì)水禽無(wú)癥狀的H6亞型禽流感病毒感染雞后，可引起雞產(chǎn)蛋率下降和上呼吸道病理變化，甚至導(dǎo)致感染雞死亡。然而該病毒一直未被引起重視，直到 1997年香港爆發(fā)人禽流感之后，Chin等[6]報(bào)道從野鴨分離到一株H6亞型禽流感病毒(A/teal/HongKong/W312/97)，該病毒與致人死亡流感病毒 A/HongKong/156/97 (H5N1) 株有7個(gè)基因高度同源，從而表明H6亞型禽流感病毒可能是H5N1流感病毒基因提供者，兩者重組后的新病毒突破了物種間的屏障，獲得了直接感染人的能力。H6亞型禽流感病毒比其他的流感病毒具有更廣泛的宿主，能夠直接感染哺乳動(dòng)物，陳妍梅[7]在從事家禽養(yǎng)殖的人血清中檢測(cè)到H6亞型禽流感抗體。因此，H6亞型AIV在公共衛(wèi)生意義方面也受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。

由于家禽感染H6亞型禽流感病毒后癥狀較輕，在臨床上很難鑒別。為了解決臨床診斷的困難，本研究建立了H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。該方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床上多次驗(yàn)證，證明其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高，可用于H6亞型流感病毒的篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與設(shè)備 RNA 提取試劑盒、一步法熒光RT-PCR檢測(cè)劑盒均購(gòu)自寶生物公司；熒光定量 PCR 儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的QuantStudioTM6 Flex。

1.1.2 參考毒株和陽(yáng)性質(zhì)粒 H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亞型 AIV和雞新城疫病毒(NDV)的 RNA 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、馬立克氏病毒(MDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和 H6亞型 AIV HA陽(yáng)性質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) H6 亞型 AIV HA基因序列保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，上游引物 H6序列：5-′CCTGAGCCTTGAGAATTTTC-A，下游引物H6R序列：5′-GGATAGGAGAATGCCCCA-3′，探針Probe H6序列：FAM-CCATCTATCATTCCAGTCCATCCTCC，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 192 bp，引物和探針由上海生物工程有限公司合成。

1.1.4 樣品來(lái)源 本實(shí)驗(yàn)室 2013 年～2017年從廣西各地采集的 376 份病禽樣品和 1967 份家禽拭子。

1.2 方法

1.2.1 待檢樣品的處理 取病禽肺臟、脾臟和氣管各1g加入1 mL滅菌的PBS緩沖液，用組織搗碎機(jī)研磨5min后，以8000rpm離心 5 min，取樣品上清備用；棉拭子樣品直接加入PBS緩沖液1 mL，振蕩混勻，取樣品上清備用。

1.2.2 待檢樣品總RNA提取 將1.2.1處理的待檢樣品上清按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取。

1.2.3 熒光定量 RT-PCR 體系建立 在冰浴條件下，在 PCR反應(yīng)管中按下表用量分別加入各成分：

─ 2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ：10 μL；

─ Ex Taq HS(5 U/μL)：0.4 μL；

─ PrimeScript RT Enzyme MixⅡ：0.4 μL；

─ H6F引物：0.4 μL；

─ H6R引物：0.4 μL；

─ Probe H6探針：0.8 μL；

─ ROX Reference Dye II：0.4 μL；

─ 待檢總 RNA 模板：5 μL；

─ DEPC處理水：2.2 μL。

加入試劑后立即離心混勻，置于熒光定量PCR儀中，用如下程序進(jìn)行反應(yīng)：第一階段42 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 5 min，95 ℃ 變性10 S；第二階段 95 ℃ 變性5 S，60 ℃ 退火延伸35 S，共 40 個(gè)循環(huán)；熒光收集設(shè)置在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行。

1.2.4 熒光定量 RT-PCR的敏感性試驗(yàn) 用核酸蛋白分析儀測(cè)定H6亞型AIV HA陽(yáng)性質(zhì)粒的濃度，將其作系列稀釋?zhuān)蛊浣K濃度分別為1.9 × 107～1.9× 101拷貝/ μL等7個(gè)梯度，以此作為模板，分別進(jìn)行一步法熒光定量 RT-PCR反應(yīng)；以確定該方法的敏感性。

1.2.5 熒光定量 RT-PCR的特異性試驗(yàn) 對(duì)H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亞型禽流感病毒和NDV的核酸以及本實(shí)驗(yàn)室保存IBDV、IBV、MDV、ILTV等樣品提取核酸作為模板，用已建立的H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.6 熒光定量 RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 將H6亞型禽流感病毒陽(yáng)性質(zhì)粒做10倍系列倍比稀釋?zhuān)∑渲械?.9×107拷貝/μL、1.9×104拷貝/μL、1.9×10拷貝/μL等3個(gè)濃度，用已建立的H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)3個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)試驗(yàn)，根據(jù)最終的Ct值計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)，以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。

1.2.7 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的 376 份病禽樣品和 1967 份家禽棉拭子樣品分別用本研究建立熒光定量 RT-PCR方法和常規(guī) RT-PCR 方法對(duì)樣品中的 H6 亞型流感病毒進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法臨床實(shí)用性和兩種檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量 RT-PCR的建立

在 20 μL 反應(yīng)體系中加入 H6F 和 H6R 特異性引物和 Probe H6 探針以及H6 亞型禽流感病病毒 RNA，于熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行一步法熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)。得到了典型 H6 亞型禽流感病毒擴(kuò)增曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖 1。

2.2 熒光定量 RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

以 10 倍倍比稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行一步法熒光定量 RT-PCR。結(jié)果，擴(kuò)增曲線(xiàn)與 Ct 值之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)可達(dá) 0.999 以上；該方法對(duì) H6 亞型 AIV 陽(yáng)性質(zhì)粒的檢出下限為 19 拷貝/μL，結(jié)果見(jiàn)圖 2。

2.3 熒光定量 RT-PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

H6亞型禽流感病毒的一步法熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，只有 H6 亞型 AIV 的 RNA 或 H6 亞型 AIV HA陽(yáng)性質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性，其它對(duì)照樣品均為陰性，結(jié)果見(jiàn)圖3。

1.H6 亞型禽流感病毒； 2.陰性對(duì)照。圖1 H6亞型流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖1-7分別為: 1.9×107拷貝/μL ;1.9×106拷貝/μL; 1.9×105拷貝/μL; 1.9×104拷貝/μL; 1.9×103拷貝/μL; 1.9×102拷貝/μL; 1.9×101拷貝/μL;8.陰性對(duì)照?qǐng)D2 H6亞型禽流感病毒熒光定量 RT-PCR檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果1:H6陽(yáng)性質(zhì)粒;2:H6;3:H1; 4: H3; 5:H4 6: H5; 7: H7; 8: H9; 9: NDV、10:IBV; 11: ILTV; 12:IBDV; 13: MDV;14:陰性對(duì)照?qǐng)D3 H6亞型禽流感病毒熒光定量 RT-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 熒光定量 RT-PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將1.0×107拷貝/μL、1.0×104拷貝/μL、10 拷貝/μL濃度的H6亞型 AIV 陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板用一步法熒光定量 RT-PCR 進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明該方法的組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于 1.5 %，詳見(jiàn)下表。

一步法熒光定量RT-PCR的重復(fù)性分析

2.5 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

利用所建立H6亞型禽流感病毒熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的 376 份臨床病料和 1967 份家禽棉拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果共檢測(cè)到 H6 亞型禽流感核酸陽(yáng)性樣品 181 份。同時(shí)，用普通 RT-PCR 方法對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果 H6 亞型禽流感核酸陽(yáng)性樣品158 份，兩種方法符合率為 87.29 %。熒光定量 RT-PCR 的敏感性高于普通 RT-PCR。

3 討論

H6 亞型 AIV 是低致病性禽流感病毒，感染該病毒的家禽幾乎無(wú)任何臨床癥狀，但它可能通過(guò)候鳥(niǎo)和水禽的隱性感染在禽類(lèi)之間傳播。廣西因氣候溫暖，水網(wǎng)密布，適合水禽飼養(yǎng)，同時(shí)也是多種侯鳥(niǎo)遷徙路線(xiàn)的必經(jīng)之地，因而為H6亞型 AIV提供了適宜的宿主和傳播的機(jī)會(huì) 。從低致病性禽流感病毒的流行病學(xué)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，H6 亞型 AIV 是從水禽禽流感病毒優(yōu)勢(shì)毒株[8]。因此，對(duì)廣西家禽加強(qiáng) H6 亞型 AIV 的監(jiān)測(cè)具有重要意義。目前對(duì)于 H6 亞型 AIV 檢測(cè)的傳統(tǒng)方法有病毒分離與鑒定、血凝抑制試驗(yàn) (HI)、一步法普通 RT-PCR 和 SYBR GreenⅠ熒光染料法 PCR 等。由于病毒分離與鑒定周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、容易散毒等；血凝抑制試驗(yàn) (HI)的特異性不強(qiáng)，容易發(fā)生交叉反應(yīng)；而一步法普通 RT-PCR 需要在 PCR 后進(jìn)行處理或電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間也比較長(zhǎng)；SYBR GreenⅠ熒光染料 RT-PCR 則因染料本身的特性較易發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)；以上這些檢測(cè)方法的缺點(diǎn)均給H6亞型禽流感的檢測(cè)帶來(lái)困擾。而熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法采用了引物和探針的“雙保險(xiǎn)”，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性，而且具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因而更適于臨床樣品的檢測(cè)。

本研究建立的H6 亞型禽流感病毒熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)方法用于臨床樣品檢測(cè)，與普通RT-PCR相比，敏感性更高，兩種方法的檢測(cè)符合率約為 87.29 %。采用該方法從取到樣品到得出檢測(cè)結(jié)果，只需要3小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，為快速檢測(cè) H6 亞型 AIV 提供了較好的技術(shù)平臺(tái)。