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    色氨酸合成酶基因工程菌合成S-甲基-L-半胱氨酸

    2018-09-20 07:27:18徐禮生高貴珍曹穩(wěn)根張興桃焦慶才鮑妮娜
    食品與生物技術(shù)學報 2018年6期
    關鍵詞:絲氨酸硫醇色氨酸

    徐禮生, 高貴珍, 曹穩(wěn)根,趙 亮, 張興桃, 焦慶才, 鮑妮娜, 宋 曼

    (1.宿州學院 生物與食品工程學院,安徽 宿州 234000;2.南京大學 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 南京210093)

    氨基酸是生物體生命不可或缺的重要組成部分,L-半胱氨酸衍生物S-甲基-L-半胱氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,它在生物成分分析中具有一定作用[1],S-甲基-L-半胱氨酸能夠有效預防神經(jīng)退化性疾病帕金森綜合癥[2],是一種重要藥物中間體,可用于肽氧化[3-4]。

    化學合成法通過L-半胱氨酸添加甲基化試劑磷酸三甲酯、二甲基碳酸酯進行制備[5-7],化學合成法存在污染嚴重、反應收率低等缺點。生物酶合成法用于有機化合物制備[8-15],通過定點突變等方式基因改造提高酶活性[16-20],微生物代謝工程改造提高酶活性[21-24]。

    作者通過L-絲氨酸與甲硫醇制備S-甲基-L-半胱氨酸(見下式)。優(yōu)化色氨酸合成酶基因工程菌酶法制備S-甲基-L-半胱氨酸反應條件,為生物法合成S-甲基-L-半胱氨酸提供了一種新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    蛋白胨、吐溫80、甲硫醇和酵母提取物:上海國藥化學試劑公司產(chǎn)品;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(純度大于98%),角蛋白水解氨基酸液:淮北市新旗氨基酸有限公司產(chǎn)品;色氨酸合成酶基因:上海生工生物工程股份有限公司;其他試劑均為分析純。

    LB液體培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,氯化鈉5,蛋白胨10;調(diào)節(jié)pH 7.0。

    LC-20AT島津高效液相色譜儀:日本島津公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 構(gòu)建 優(yōu)化大腸桿菌來源色氨酸合成酶基因[25],色氨酸合成酶菌按文獻[26]進行構(gòu)建。

    1.2.2 發(fā)酵 菌種來源于作者所在實驗室[27],菌種先進行活化,種子液體積分數(shù)為2.5%(以LB培養(yǎng)基體積為基準)加入250 mL的搖瓶進行發(fā)酵,37℃、搖床 170 r/min、DM206種子液發(fā)酵 4 h,加入0.4 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,28℃發(fā)酵12 h,發(fā)酵后離心,無菌超純水對基因工程菌菌體進行洗滌,冰箱保存?zhèn)溆茫?℃)。

    1.2.3 反應 L-絲氨酸反應底物濃度1.0 mol/L,底物甲硫醇濃度1.2 mol/L,調(diào)節(jié)pH至8.0,溫度37℃,加入離心所得濕菌體0.05 g,吐溫80質(zhì)量濃度0.2g/mL,搖床恒溫條件下振蕩頻率設為180 r/min,S-甲基-L-半胱氨酸質(zhì)量濃度通過HPLC測定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 蛋白質(zhì)表達

    克隆的trpBA基因片段全長為2 000 bp,見圖1。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為45 000和30 000,見圖2。色氨酸合成酶具有aaββ亞基結(jié)構(gòu)異質(zhì)四聚體,其a、β亞基分別由trp A和trp B基因編碼,圖2工程菌蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果表明,蛋白質(zhì)表達與色氨酸合成酶蛋白一致。

    圖1 工程菌質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Engineered microorganism plasmid agarose gel electrophoresis

    圖2 工程菌蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 Engineered microorganism protein SDS-PAGE analysis

    2.2 pH對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

    pH通過改變酶空間構(gòu)象、氨基酸殘基微環(huán)境而影響酶活性,pH影響酶與底物之間的結(jié)合狀態(tài)使酶活性發(fā)生改變,基因工程菌色氨酸合成酶的活性中心相關基團解離形態(tài)隨著pH的變化而變化,從而影響酶與底物L-色氨酸以及甲硫醇的結(jié)合,合成S-甲基-L-半胱氨酸需要在合適的pH反應介質(zhì)中進行。改變反應體系pH,測得L-絲氨酸轉(zhuǎn)化率與pH關系,見圖3。當反應液pH為8時,底物甲硫醇、L-絲氨酸與色氨酸合成酶結(jié)合位點比較合適。

    圖3 pH對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of pH on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

    2.3 溫度對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

    反應溫度對酶的熱穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)化率有一定的影響。研究了反應溫度對色氨酸合成酶基因工程菌轉(zhuǎn)化率的影響,見圖4??梢钥闯?,在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高(25~37℃),轉(zhuǎn)化率逐漸提高;在37~55℃時,色氨酸合成酶轉(zhuǎn)化率逐漸減小。

    圖4 溫度對反應轉(zhuǎn)化率影響Fig.4 Effects of temperature on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

    2.4 底物濃度對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

    底物濃度會影響色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應結(jié)果,當?shù)孜風-絲氨酸濃度處在低水平時,色氨酸合成酶基因工程菌酶活隨著底物濃度增加而提高;而底物L-絲氨酸濃度過高時,對色氨酸合成酶會發(fā)生底物抑制作用,結(jié)果見圖5。L-絲氨酸最適合濃度為300 mmol/L。

    圖5 底物濃度對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

    2.5 底物摩爾比影響

    研究了底物摩爾比對色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應的影響,見圖6??梢钥闯?,甲硫醇/L-絲氨酸摩爾比為1∶1時酶活恒定,最佳甲硫醇/L-絲氨酸摩爾比為1∶1。

    圖6 底物摩爾比對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of the substrates molar ratio on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

    2.6 響應面法優(yōu)化S-甲基-L-半胱氨酸制備

    S-甲基-L-半胱氨酸合成過程中,反應溫度、pH和底物濃度的影響較大,采用中心組合設計方法,以反應 pH(A)、溫度(B)和底物濃度(C)為自變量,S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率(R1)為響應值設計實驗,見表1-2。

    利用Design expert 8.05b軟件對重組色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應實驗結(jié)果進行方差分析,結(jié)果見表3(P值<0.05,顯著)。由表3可以看出,S-甲基-L-半胱氨酸反應中的AB、A2、B2為顯著影響因素。圖7-9為各因素間響應曲面圖。利用Design expert 8.05b軟件預測,反應溫度、pH和L-絲氨酸底物濃度分別為39℃、8.5和360 mmol/L時S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為82.4%。按照預測結(jié)果進行驗證,重復4次實驗平均轉(zhuǎn)化率為83.2%。S-甲基-L-半胱氨酸制備過程中會產(chǎn)生少量副產(chǎn)物,經(jīng)過檢測主要是L-絲氨酸在基因工程菌整細胞催化反應條件下產(chǎn)生少量的丙酮酸。

    表1 中心組合實驗因素水平編碼Table 1 Factor levels coding of center combination experiment

    表2 手性藥物S-甲基-L-半胱氨酸合成條件設計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken RSM design and results of S-methyl-L-cysteine

    表3 中心組合實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of L-5-hydroxytryptophan Box-Behnken RSM design

    續(xù)表3

    圖7 反應溫度與pH交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面(L-絲氨酸底物濃度為360 mmol/L)Fig.7 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between pH and temperature(substrate concentration of L-serine was 360 mmol/L)

    圖8 底物濃度與pH交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面(39℃)Fig.8 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between substrate concentration and pH(39℃)

    圖9 反應溫度與底物濃度交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面(pH 8.5)Fig.9 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between substrate concentration and temperature(pH 8.5)

    2.7 制備

    0.18 mol L-絲氨酸和 0.18 mol甲硫醇(pH 8.5), 反應體系 500 mL,4 g菌體、39 ℃反應 20 h。L-絲氨酸的轉(zhuǎn)化率達到83.2%,S-甲基-L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度為40.49 g/L。結(jié)束反應,離心去除菌體,精制烘干得S-甲基-L-半胱氨酸15.6 g,純度為99%,收率為 77.2%。 熔點 240 ℃(decomp),[α]20D=-27.5~-33.5°(c=2,H2O)。 南京大學化學分析測試中心利用紅外光譜儀檢測了本試驗制備樣品,產(chǎn)品的紅外光譜圖與標準品S-甲基-L-半胱氨酸的譜圖相同。由圖10可知,制備樣品圖譜中3 000 cm-1的吸收峰明顯變寬,說明在半胱氨酸的分子上加上了甲基基團,2 500~3 200 cm-1處寬而強的吸收峰,表明甲基與巰基反應生成S-甲基,該化合物為S-甲基-L-半胱氨酸。

    圖10 產(chǎn)品的紅外圖譜Fig.10 Infrared spectrum of the product

    3 結(jié) 語

    以甲硫醇和L-絲氨酸為底物,利用色氨酸合成酶基因工程菌催化合成S-甲基-L-半胱氨酸,最佳反應條件如下:反應溫度39℃,pH 8.5,角蛋白氨基酸水解液中L-絲氨酸濃度360 mmol/L,反應平衡時間20 h,S-甲基-L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度為40.49 g/L。

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