色氨酸合成酶基因工程菌合成S-甲基-L-半胱氨酸

徐禮生， 高貴珍， 曹穩(wěn)根，趙 亮， 張興桃， 焦慶才， 鮑妮娜， 宋 曼

（1.宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000；2.南京大學 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京210093）

氨基酸是生物體生命不可或缺的重要組成部分，L-半胱氨酸衍生物S-甲基-L-半胱氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，它在生物成分分析中具有一定作用[1]，S-甲基-L-半胱氨酸能夠有效預防神經(jīng)退化性疾病帕金森綜合癥[2]，是一種重要藥物中間體，可用于肽氧化[3-4]。

化學合成法通過L-半胱氨酸添加甲基化試劑磷酸三甲酯、二甲基碳酸酯進行制備[5-7]，化學合成法存在污染嚴重、反應收率低等缺點。生物酶合成法用于有機化合物制備[8-15]，通過定點突變等方式基因改造提高酶活性[16-20]，微生物代謝工程改造提高酶活性[21-24]。

作者通過L-絲氨酸與甲硫醇制備S-甲基-L-半胱氨酸（見下式）。優(yōu)化色氨酸合成酶基因工程菌酶法制備S-甲基-L-半胱氨酸反應條件，為生物法合成S-甲基-L-半胱氨酸提供了一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白胨、吐溫80、甲硫醇和酵母提取物：上海國藥化學試劑公司產(chǎn)品；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（純度大于98%），角蛋白水解氨基酸液：淮北市新旗氨基酸有限公司產(chǎn)品；色氨酸合成酶基因：上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為分析純。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物5，氯化鈉5，蛋白胨10；調(diào)節(jié)pH 7.0。

LC-20AT島津高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建 優(yōu)化大腸桿菌來源色氨酸合成酶基因[25]，色氨酸合成酶菌按文獻[26]進行構(gòu)建。

1.2.2 發(fā)酵 菌種來源于作者所在實驗室[27]，菌種先進行活化，種子液體積分數(shù)為2.5%（以LB培養(yǎng)基體積為基準）加入250 mL的搖瓶進行發(fā)酵，37℃、搖床 170 r/min、DM206種子液發(fā)酵 4 h，加入0.4 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，28℃發(fā)酵12 h，發(fā)酵后離心，無菌超純水對基因工程菌菌體進行洗滌，冰箱保存?zhèn)溆茫?℃）。

1.2.3 反應 L-絲氨酸反應底物濃度1.0 mol/L，底物甲硫醇濃度1.2 mol/L，調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度37℃，加入離心所得濕菌體0.05 g，吐溫80質(zhì)量濃度0.2g/mL，搖床恒溫條件下振蕩頻率設為180 r/min，S-甲基-L-半胱氨酸質(zhì)量濃度通過HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)表達

克隆的trpBA基因片段全長為2 000 bp，見圖1。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為45 000和30 000，見圖2。色氨酸合成酶具有aaββ亞基結(jié)構(gòu)異質(zhì)四聚體，其a、β亞基分別由trp A和trp B基因編碼，圖2工程菌蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果表明，蛋白質(zhì)表達與色氨酸合成酶蛋白一致。

圖1 工程菌質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳Fig.1 Engineered microorganism plasmid agarose gel electrophoresis

圖2 工程菌蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 Engineered microorganism protein SDS-PAGE analysis

2.2 pH對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

pH通過改變酶空間構(gòu)象、氨基酸殘基微環(huán)境而影響酶活性，pH影響酶與底物之間的結(jié)合狀態(tài)使酶活性發(fā)生改變，基因工程菌色氨酸合成酶的活性中心相關基團解離形態(tài)隨著pH的變化而變化，從而影響酶與底物L-色氨酸以及甲硫醇的結(jié)合，合成S-甲基-L-半胱氨酸需要在合適的pH反應介質(zhì)中進行。改變反應體系pH，測得L-絲氨酸轉(zhuǎn)化率與pH關系，見圖3。當反應液pH為8時，底物甲硫醇、L-絲氨酸與色氨酸合成酶結(jié)合位點比較合適。

圖3 pH對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of pH on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

2.3 溫度對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

反應溫度對酶的熱穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)化率有一定的影響。研究了反應溫度對色氨酸合成酶基因工程菌轉(zhuǎn)化率的影響，見圖4?？梢钥闯?，在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高（25～37℃），轉(zhuǎn)化率逐漸提高；在37～55℃時，色氨酸合成酶轉(zhuǎn)化率逐漸減小。

圖4 溫度對反應轉(zhuǎn)化率影響Fig.4 Effects of temperature on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

2.4 底物濃度對色氨酸合成酶基因工程菌反應的影響

底物濃度會影響色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應結(jié)果，當?shù)孜風-絲氨酸濃度處在低水平時，色氨酸合成酶基因工程菌酶活隨著底物濃度增加而提高；而底物L-絲氨酸濃度過高時，對色氨酸合成酶會發(fā)生底物抑制作用，結(jié)果見圖5。L-絲氨酸最適合濃度為300 mmol/L。

圖5 底物濃度對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

2.5 底物摩爾比影響

研究了底物摩爾比對色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應的影響，見圖6?？梢钥闯?，甲硫醇/L-絲氨酸摩爾比為1∶1時酶活恒定，最佳甲硫醇/L-絲氨酸摩爾比為1∶1。

圖6 底物摩爾比對色氨酸合成酶基因工程菌反應轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of the substrates molar ratio on conversion rate of tryptophan synthase genetically engineered microorganism

2.6 響應面法優(yōu)化S-甲基-L-半胱氨酸制備

S-甲基-L-半胱氨酸合成過程中，反應溫度、pH和底物濃度的影響較大，采用中心組合設計方法，以反應 pH（A）、溫度（B）和底物濃度（C）為自變量，S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率（R1）為響應值設計實驗，見表1-2。

利用Design expert 8.05b軟件對重組色氨酸合成酶基因工程菌酶促反應實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3（P值＜0.05，顯著）。由表3可以看出，S-甲基-L-半胱氨酸反應中的AB、A2、B2為顯著影響因素。圖7-9為各因素間響應曲面圖。利用Design expert 8.05b軟件預測，反應溫度、pH和L-絲氨酸底物濃度分別為39℃、8.5和360 mmol/L時S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為82.4%。按照預測結(jié)果進行驗證，重復4次實驗平均轉(zhuǎn)化率為83.2%。S-甲基-L-半胱氨酸制備過程中會產(chǎn)生少量副產(chǎn)物，經(jīng)過檢測主要是L-絲氨酸在基因工程菌整細胞催化反應條件下產(chǎn)生少量的丙酮酸。

表1 中心組合實驗因素水平編碼Table 1 Factor levels coding of center combination experiment

表2 手性藥物S-甲基-L-半胱氨酸合成條件設計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken RSM design and results of S-methyl-L-cysteine

表3 中心組合實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis of L-5-hydroxytryptophan Box-Behnken RSM design

續(xù)表3

圖7 反應溫度與pH交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面（L-絲氨酸底物濃度為360 mmol/L）Fig.7 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between pH and temperature（substrate concentration of L-serine was 360 mmol/L）

圖8 底物濃度與pH交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面（39℃）Fig.8 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between substrate concentration and pH（39℃）

圖9 反應溫度與底物濃度交互作用對S-甲基-L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化率的響應面（pH 8.5）Fig.9 Response surface plot of S-methyl-L-cysteine bioconversion rate interaction between substrate concentration and temperature（pH 8.5）

2.7 制備

0.18 mol L-絲氨酸和 0.18 mol甲硫醇（pH 8.5）， 反應體系 500 mL，4 g菌體、39 ℃反應 20 h。L-絲氨酸的轉(zhuǎn)化率達到83.2%，S-甲基-L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度為40.49 g/L。結(jié)束反應，離心去除菌體，精制烘干得S-甲基-L-半胱氨酸15.6 g，純度為99%，收率為 77.2%。 熔點 240 ℃（decomp），[α]20D=-27.5～-33.5°（c=2，H2O）。 南京大學化學分析測試中心利用紅外光譜儀檢測了本試驗制備樣品，產(chǎn)品的紅外光譜圖與標準品S-甲基-L-半胱氨酸的譜圖相同。由圖10可知，制備樣品圖譜中3 000 cm-1的吸收峰明顯變寬，說明在半胱氨酸的分子上加上了甲基基團，2 500～3 200 cm-1處寬而強的吸收峰，表明甲基與巰基反應生成S-甲基，該化合物為S-甲基-L-半胱氨酸。

圖10 產(chǎn)品的紅外圖譜Fig.10 Infrared spectrum of the product

3 結(jié) 語

以甲硫醇和L-絲氨酸為底物，利用色氨酸合成酶基因工程菌催化合成S-甲基-L-半胱氨酸，最佳反應條件如下：反應溫度39℃，pH 8.5，角蛋白氨基酸水解液中L-絲氨酸濃度360 mmol/L，反應平衡時間20 h，S-甲基-L-半胱氨酸的質(zhì)量濃度為40.49 g/L。