鮑魚褐藻膠裂解酶基因的原核表達及酶學性質

張 齊 ， 李云濤 ， 汪立平 *

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

褐藻膠（Alginate）是由 β-1，4-D-甘露糖醛酸（M）和α-1，4-L-古羅糖醛酸 （G）兩種單體通過1，4-糖苷鍵鏈接而成的線性多糖聚合物，主要來自于海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻類植物[1]。近年來，褐藻膠的酶解產物褐藻膠寡糖因其能促進雙歧桿菌的生長[2]、能促進植物根系生長[3]、抗氧化活性[4]、抗病原體[5]等生理活性而受到越來越多的關注。

褐藻膠裂解酶能通過β消去機制催化褐藻膠的降解成寡糖和不飽和的糖醛酸，其作用位點是1，4糖苷鍵[6]。褐藻膠裂解酶主要來源于海洋藻類、海洋軟體動物和海洋微生物[7]。

褐藻膠裂解酶可直接將彈性的褐藻藻體轉變?yōu)闈{狀，同時釋放出降解的褐藻膠寡糖，而這種將褐藻變成高附加值原料的技術關鍵在于褐藻膠裂解酶。為了大規(guī)模的應用褐藻膠裂解酶來降解褐藻，需要提供大量低成本的酶。目前，相對于細菌來源的褐藻膠裂解酶，軟體動物來源的褐藻膠裂解酶的研究較少；目前已經從角蠑螺Turbo cornutus[8]、濱螺Littorina sp.[9]、 黑斑海兔 Littorina brevicula[10]、皺紋盤鮑Haliotis discus hannai[11-12]等軟體動物分離出褐藻膠裂解酶。雖然人們已經反復研究了軟體動物來源的褐藻膠裂解酶的常規(guī)生化特性，但目前僅成功克隆了皺紋盤鮑Haliotis discus hannai[11]、短濱螺Aplysia kurodai[13]、黑斑海兔Littorina brevicula[14]少數種類軟體動物褐藻膠裂解酶的基因。皺紋盤鮑重組蛋白為包涵體，復性后沒有活性，短濱螺、黑斑海兔重組酶的比酶活分別為1 147.2 U/mg和2 100 U/mg；均具有多聚甘露糖醛酸底物特異性。

本研究中，以鮑魚來源的一種適冷性和多聚甘露糖醛酸底物特異性的褐藻膠裂解酶為研究對象，參考皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶的cDNA序列，通過RT-PCR克隆到編碼鮑魚褐藻膠裂解酶成熟肽的cDNA片段，將其連接至pET-28a（+）原核表達質粒在大腸桿菌中進行表達；純化了重組蛋白，并對其酶學性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌種 大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）：購自北京天根生物科技公司；克隆載體pEASY-T3：購自全式金生物技術有限公司；表達載體pET-28a（+）：作者所在實驗室保存。

1.1.2 試劑 Total RNA Extractor（Trizol）試劑盒、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、甲叉雙丙烯酰胺、Tris base、丙烯酰胺、考馬斯亮藍G250、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、DNA相對分子質量標準品、蛋白質相對分子質量標準品：購自上海生工生物工程有限公司；限制性內切酶Bam HI和Nde I，T4 DNA連接酶：購自New England Biolabs；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Taq PCR MasterMix：購自北京天根生化科技有限公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒：購自全式金生物有限公司；蛋白質純化Ni-NTA Agarose：購自QIAGEN。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 algl基因克隆 取適量新鮮肝胰腺組織，使用Total RNA Extractor試劑盒提取總RNA。提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280鑒定，紫外分光光度計法檢測其濃度后貯于-80℃冰箱備用。用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成第一鏈cDNA。參考皺紋盤鮑褐藻膠裂解 酶 的 核 苷 酸 序 列 （GenBank：AB110094.1），用Primer premier 5.0軟件設計正向引物AlgF（5'-GCTGCGGCA GAAAGTCGACCAG-3'）和反向引物AlgR（5'-GATGTGGCGTGTACATG-3'），用以擴增鮑魚褐藻膠裂解酶的全長cDNA。采用T-A克隆法，將擴增得到的cDNA連接到pEASY-T3載體，將連接物轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP10后，涂布于含氨芐青霉素和IPTG的抗性平板，37℃靜置培養(yǎng)16～20 h。通過藍白班篩選陽性轉化子，對其進行DNA測序，測序正確的重組質粒命名為pEASYT3-algl。

1.2.2 pET-28a-algl表達載體構建 提取pEASYT3-algl質粒，以其為模板，設計分別添加Nde I和Bam HI酶切位點的正向引物ExF （5'-CGAACAATGTATTGTGACACATAAAG-3'）和反向引物 ExR（5'-GATGTTGGATCCTACATG TGTACA-3'）對編碼algl成熟肽的cDNA片段進行PCR擴增。擴增的片段進行Nde I、Bam HI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳割膠回收目的片段，將其與用同樣酶處理過的表達載體pET-28a按15∶1連接，在T4 DNA連接酶作用下，16℃保溫16 h，轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌TOP10，通過菌落PCR、雙酶切和DNA測序對重組表達載體pET-28a-algl進行篩選。

1.2.3 algl基因的誘導表達 重組質粒pET-28aalgl提純后轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，將轉化細胞接種于10 mL含50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后，取1 mL轉接入100 mL含50 ug/mL硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時，取1 mL菌液做未誘導對照；剩余培養(yǎng)液加入IPTG至1 mmol/L，28℃、180 r/min誘導表達6 h，菌液10 000 r/min離心10 min，4℃離心收集菌體，菌體重懸于10 mL裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，20% 甘 油 ，1%Trition X-100），用超聲波破碎菌體，破碎條件：破碎功率150 W，工作/間隙時間為4 s/8 s，時間15 min，冰浴。破碎液10 000 r/min、4℃離心10 min，分別收集上清液、沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 包涵體蛋白純化、復性 包涵體重懸于2 mL溶解緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L尿素，12 mmol/L 2-巰基乙醇），室溫下不停攪拌1 h。13 000 r/min、離心15 min，4℃離心收集上清液，去除沉淀。

先用4 mL平衡Ni-NTA resin，緩慢倒入2 mL包涵體溶解液，使蛋白質與Ni-NTA樹脂充分結合（4 ℃，150 r/min，1 h），隨后用 5 mL 漂洗緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L 尿素 ，10 mmol/L咪唑）漂洗兩次來洗掉未結合成分，最后用1 mL洗脫緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，8 mol/L 尿素，250 mmol/L咪唑）將重組蛋白Algl洗脫下來。

通過Ni-NTA純化得到的重組蛋白Algl逐滴滴加到10 mL復性緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，5 mmol/L還原型谷胱甘肽，1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）中至蛋白質終質量濃度20 μg/mL，4℃下不停的攪拌24 h。將蛋白質溶液放入處理好的透析袋中，兩端用細線系好，將透析袋放入裝有50mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）的燒杯，4 ℃攪拌透析 24 h。透析后的蛋白質溶液即為復性的重組蛋白Algl溶液，用于酶活測定及酶學性質研究。

1.2.5 酶活力測定 褐藻膠裂解酶酶活力測定參照Preiss方法[15]，將0.1 mL酶液加入2.9 mL體積分數 0.1%褐藻酸鈉 （50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中混合，在35℃下保溫20 min后測量反應前后在235 nm處的吸光度值。在235 nm處反應液吸光度值每分鐘增加0.01定義為一個酶活單位（U）。

1.2.6 溫度、pH對褐藻膠裂解酶活性及穩(wěn)定性的影響 重組蛋白最適催化溫度和溫度穩(wěn)定性測定，將0.1 mL酶液添加到2.9 mL體積分數0.1%海藻酸鈉溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）中，在 20～70℃水浴條件下反應20 min后測定酶活，將最高酶活力設為100%；將酶液放置在不同的溫度下保溫1 h后按1.2.5測定殘余酶活力，將初始酶活力設為100%。

重組蛋白最適催化pH值和pH穩(wěn)定性測定，將0.1 mL酶液添加到2.9 mL不同pH的0.1%海藻酸鈉溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 3.0～10.6）中，在 35℃保溫20 min后測定酶活，將最高酶活力設為100%；將酶液添加到不同pH的緩沖液中冰浴1 h后按1.2.5測定酶的殘余活力，將初始的酶活力設為100%。

1.2.7 EDTA、金屬離子對酶活的影響 將金屬離子 化 合 物 KCl、NaCl、CaCl2、MnCl2、MgCl2、CuCl2、FeCl3、ZnCl2和 EDTA、SDS 分別加入 Tris-HCl（50mmol/L，pH 8.0）中配制成1 mmol/L的溶液，以添加相同體積水作為對照組，調節(jié)pH至8.0，測定不同反應體系下的酶活力。

1.2.8 褐藻膠裂解酶底物特異性以及動力學測定多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）、不規(guī)則雜合片段（pMG）的制備參照Gacesa[16]的方法。將海藻酸鈉、多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）、不規(guī)則雜合片段（pMG）四種底物加入Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）配成0.1%的反應液，按1.2.4方法測定不同時間的吸光度值。

重組酶動力學分析，通過測定酶在Tris-HCl緩沖液 （pH 8.0）中不同底物質量濃度 [S]（0.625～5.0 mg/mL）下的反應速度V來確定酶催化的最大速度Vmax和米氏參數Km。取2.9 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液加入0.1 mL酶液，總反應體系3 mL，于35℃保溫20 min，再測定反應液在235 nm處的吸光度值。根據雙倒數作圖法（Lineweaver-Burk），將反應速度的倒數1/V對底物濃度的倒數1/[S]作圖，通過計算橫截距和縱截距求出米氏常數Km和Vmax。

2 結果與分析

2.1 algl基因的克隆

以鮑魚肝胰腺第一鏈cDN為模板，用一對根據皺紋盤鮑褐藻膠裂解酶基因的核苷酸序列設計的特異性引物AlgF、AlgR，通過PCR擴增得到algl的cDNA，見圖1。將其與pEASY-T3載體連接，轉化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，對藍白斑篩選得到的陽性克隆子pEASY-T3-algl進行DNA測序。

測序結果表明，該片段全長822 bp，編碼273個氨基酸algl基因GenBank登錄號為：KP406582。

圖1 鮑魚肝胰腺總RNA和algl基因PCR擴增Fig.1 Total RNA of abalone hepatopancreas and PCR amplification of algl gene

2.2 重組表達質粒的構建

以重組質粒pEASY-T3-algl為模板，以ExF、ExR為引物，通過PCR擴增得到編碼Algl成熟肽片段，將Algl成熟肽片段和pET-28a經Nde I和Bam HI雙酶切及純化回收后，通過T4 DNA連接酶連接后得到重組表達載體pET-28a-algl。通過菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現，在約 1 060 bp處有清晰條帶，見圖2（a），與理論相符；進一步對該載體采用Nde I和Bam HI雙酶切處理，經1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，該載體經雙酶切后存在兩條譜帶，其中一條約為780 bp的譜帶屬于目的片段，見圖2（b）；最后通過DNA測序，結果顯示目的基因沒有突變并且讀碼框正確。

圖2 重組表達載體pET-28a-algl的菌落PCR雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant expression vector pET-28a-algl by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白的誘導表達 、鑒定及包涵體的純化

含重組表達質粒pET-28a-algl的大腸桿菌BL21（DE3）在 28 ℃、1 mmol/L IPTG 誘導培養(yǎng) 6 h后，成功表達了重組蛋白Algl（圖3，泳道2）。細胞經超聲波破碎后，通過SDS-PAGE發(fā)現，該蛋白質以包涵體形式存在（圖3，泳道4）。包涵體蛋白質溶解，變性條件下經Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱親和層析純化后，復性、透析得到重組褐藻膠裂解酶（圖3，泳道5）。由圖3可以看出，重組蛋白Algl相對分子質量大約32 000，與預期的融合蛋白的相對分子質量一致。純化后的重組蛋白Algl測定酶活為15.6 U/mL，比酶活為644.6 U/mg。

2.4 最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性

酶最適的反應溫度通過測定其在不同溫度下酶活力確定。由圖4知，酶的最適反應溫度35℃，其酶活為15.6 U/mL。在30～40℃范圍內有較高的催化活性，當溫度降低到20℃或升高到50℃時，酶活力都迅速下降。酶的溫度穩(wěn)定性見圖4。酶在40℃及以下較穩(wěn)定，40℃處理1 h后殘留酶活力為初始值的59.7%；而當溫度高于40℃時，殘留酶活力下降很快，在60℃下處理1 h，酶幾乎失活；表明該褐藻膠裂解酶Algl的溫度穩(wěn)定性有待進一步提高。

圖3 Alyl的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of Alyl

圖4 Alyl最適反應溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.4 Optimal temperature and thermostability of Alyl

2.5 最適反應pH及pH穩(wěn)定性

酶最適反應的pH通過測定其在不同pH下酶活力確定，結果見圖5。最適酶反應pH條件為8.0，其酶活為15.6 U/mL。當pH為7.0時，酶活力為峰值的61.9%，而當pH升高到9.0時，酶活力僅為峰值的32.1%。當褐藻膠裂解酶在pH 6.0～9.0的范圍內處理1 h后，殘留酶活力能達到60%以上，pH值再降低或升高時殘余酶活力較低，當pH降到4.0或升高到10.0時，殘留酶活力幾乎為零。此酶是一個嗜堿酶。

2.6 EDTA、金屬離子對酶活力影響

在酶的反應底物中加入1 mmol/L的EDTA、SDS和不同的金屬離子化合物，測定其酶活；以不加任何離子時的酶活力15.6 U/mL為100%。根據表1，K+、Na+、Ca2+、Mn2+對酶活有激活作用，K+對酶活的刺激作用最大，可使酶活提高19%；而Mg2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+對酶活有抑制作用，Zn2+的抑制作用在金屬離子中最強。 EDTA、SDS對酶活的抑制相對于金屬離子的作用更明顯。

圖5 Algl的最適反應pH及pH穩(wěn)定性Fig.5 Optimal pH and atability of Algl

表1 金屬離子對酶活的影響Table 1 Effect of metal cations on AlgL activity

2.7 底物特異性

四種底物用來研究褐藻膠裂解酶的底物特異性，結果見圖6。發(fā)現酶與多聚甘露糖醛酸的反應液在波長235 nm處的吸光度變化值最高，海藻酸鈉、不規(guī)則雜合片段吸光度值變化依次減小，而在多聚古洛糖醛酸中吸光度沒有發(fā)生變化。表明褐藻膠裂解酶Algl具有多聚甘露糖醛酸底物特異性，不能降解多聚古洛糖醛酸。

圖6 酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of AlgL

2.8 酶催化動力學

以不同質量濃度的海藻酸鈉為底物，測定重組酶的酶活。根據雙倒數作圖法，將酶活力的倒數1/V對底物濃度的倒數1/[S]作圖，得到一條直線，結果見圖7。通過計算直線與縱軸的截距得到最大反應速度Vmax=19.08 U/mL，直線與橫軸的截距得到米氏常數Km=1.71 mg/mL。

圖7 Algl水解褐藻膠的Lineweaver－Burke雙倒數圖Fig.7 Lineweaver－Burke plots of the alginate degradation by the Algl

3 結語

從鮑魚肝胰腺中提取RNA，通過RT-PCR得到褐藻膠裂解酶（algl）的cDNA，將其構建到pET-28a（+）上并在大腸桿菌BL21菌株中進行高效誘導表達，將菌體超聲波破碎后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測，該蛋白質以包涵體的形式表達。包涵體的形成主要是蛋白質合成速度過快，沒有足夠的時間進行折疊；對含二硫鍵較多的重組蛋白質而言，細胞質內的還原環(huán)境抑制二硫鍵的形成；重組蛋白質在大腸桿菌中表達時，缺乏一些蛋白質折疊過程中所需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，是包涵體形成的又一原因[17]。

包涵體在變性條件下用Ni-NTA瓊脂糖凝膠柱親和層析純化，將純化后的重組蛋白質復性，繼而對其進行活性檢測和酶學特性研究。純化后的Algl測定其酶活為15.6 U/mL，比酶活為644.6 U/mg，低于報道中短濱螺（1 147.2 U/mg）、黑斑海兔（2 100 U/mg）比酶活。在pH 8.0時酶活力達到最大值，屬于嗜堿性酶；底物特異性分析表明，褐藻膠裂解酶Algl具有多聚甘露糖醛酸底物特異性，不能降解多聚古洛糖醛酸；據報道，短濱螺和黑斑海兔來源的褐藻膠裂解酶同樣只具有多聚甘露糖醛酸底物特異性[12-13]，所以Algl與其他軟體動物來源的褐藻膠裂解酶同屬于多糖裂解酶家族14（PL14）。Algl最適溫度35℃，且在20～30℃處有60%以上的酶活性保留，則該酶具有適冷性，熱不穩(wěn)定性；而報道中短濱螺和黑斑海兔來源的褐藻膠裂解酶最適溫度分別為55℃和50℃[12-13]。重組酶Algl的這種適冷性和熱不穩(wěn)定性可以很好的用于工業(yè)生產，低溫反應的酶可以降低因加熱而產生的生產成本，熱不穩(wěn)定性對于工業(yè)生產是很有利的，只需要適當的提高溫度就可以很容易和選擇性的滅活。